| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-37页 |
| ·东方拟无枝酸菌与ECO-0501 | 第14-20页 |
| ·东方拟无枝酸菌 | 第14页 |
| ·ECO-0501的发现 | 第14-15页 |
| ·ECO-0501的生物合成 | 第15-18页 |
| ·其他多烯聚酮类化合物 | 第18-20页 |
| ·聚酮化合物及聚酮合酶 | 第20-24页 |
| ·Ⅰ型PKS | 第21-22页 |
| ·Ⅱ型PKS | 第22页 |
| ·Ⅲ型PKS | 第22-24页 |
| ·Ⅰ型PKS的基因工程 | 第24-25页 |
| ·聚酮合酶的异源表达 | 第24页 |
| ·聚酮合酶分子改造策略 | 第24-25页 |
| ·拟无枝酸菌的遗传操作 | 第25-28页 |
| ·拟无枝酸菌克隆载体的发展 | 第25-27页 |
| ·拟无枝酸菌的转化方法 | 第27-28页 |
| ·链霉菌抗生素代谢调控 | 第28-32页 |
| ·级联调控 | 第28页 |
| ·全局调控 | 第28-31页 |
| ·SARP家族蛋白 | 第31页 |
| ·LAL家族蛋白 | 第31-32页 |
| ·PKS合成途径中的硫酯酶 | 第32-35页 |
| ·Ⅰ型硫酯酶(TE Ⅰ) | 第32-33页 |
| ·Ⅱ型硫酯酶(TE Ⅱ) | 第33-35页 |
| ·本课题研究目的与内容 | 第35-37页 |
| ·课题背景 | 第35-36页 |
| ·内容及目标 | 第36-37页 |
| 第2章 东方拟无枝酸菌粘粒文库中ECO-0501生物合成基因簇的筛选 | 第37-48页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·实验材料 | 第37-39页 |
| ·菌种 | 第37页 |
| ·实验试剂 | 第37-38页 |
| ·培养基及主要溶液 | 第38-39页 |
| ·实验仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-42页 |
| ·东方拟无枝酸菌基因组粘粒文库的活化 | 第39页 |
| ·碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA | 第39-40页 |
| ·DNA片段凝胶回收 | 第40页 |
| ·质粒DNA的酶切 | 第40页 |
| ·探针的制备 | 第40-41页 |
| ·菌落原位杂交膜的制备 | 第41-42页 |
| ·菌落原位杂交 | 第42页 |
| ·粘粒克隆的两端定位 | 第42页 |
| ·结果与讨论 | 第42-46页 |
| ·阳性杂交信号点的PCR鉴定 | 第42-43页 |
| ·阳性粘粒克隆的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·阳性克隆粘粒的提取及酶切 | 第44-46页 |
| ·阳性克隆粘粒的两端定位 | 第46页 |
| ·本章小结 | 第46-48页 |
| 第3章 ECO-orf4基因功能的研究 | 第48-75页 |
| ·引言 | 第48页 |
| ·试验材料 | 第48-50页 |
| ·菌种及质粒 | 第48-49页 |
| ·试验试剂 | 第49-50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·主要溶液 | 第50页 |
| ·试验仪器 | 第50页 |
| ·试验方法 | 第50-58页 |
| ·东方拟无枝酸菌的培养 | 第50页 |
| ·粘粒电转化E.coli BW25113/pIJ790 | 第50-51页 |
| ·东方拟无枝酸菌粘粒的PCR-targeting | 第51页 |
| ·热诱导FLP重组酶敲除抗性基因盒 | 第51-52页 |
| ·东方拟无枝酸菌DNA的提取 | 第52页 |
| ·东方拟无枝酸菌RNA的提取 | 第52-53页 |
| ·粘粒从大肠杆菌向东方拟无枝酸菌的接合转移 | 第53页 |
| ·东方拟无枝酸菌电转化 | 第53页 |
| ·Southern blot | 第53-54页 |
| ·逆转录反应 | 第54页 |
| ·PCR反应 | 第54-56页 |
| ·目的产物的HPLC检测 | 第56-57页 |
| ·生物活性检测 | 第57页 |
| ·大肠杆菌的培养和保藏 | 第57页 |
| ·质粒与外源片段的连接 | 第57页 |
| ·大肠杆菌的诱导表达 | 第57页 |
| ·菌体破碎 | 第57-58页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-74页 |
| ·ECO-orf4生物信息学分析 | 第58-59页 |
| ·ECO-orf4敲除质粒pLYSY04的构建 | 第59-61页 |
| ·ECO-orf4缺失突变株的筛选 | 第61-62页 |
| ·ECO-orf4缺失突变株的发酵验证 | 第62-63页 |
| ·ECO-orf4互补质粒的构建 | 第63页 |
| ·ECO-orf4互补突变株的筛选 | 第63-65页 |
| ·ECO-orf4互补突变株的发酵验证 | 第65-66页 |
| ·ECO-orf4过表达质粒的构建 | 第66-67页 |
| ·ECO-orf4过表达工程菌的筛选 | 第67页 |
| ·ECO-orf4过表达工程菌的发酵验证 | 第67页 |
| ·ECO-orf4及ECO-0501生物合成相关基因的RT-PCR分析 | 第67-69页 |
| ·ECO-orf4的缺失对ECO-0501生物合成相关基因转录的影响 | 第69页 |
| ·重组质粒pET-30a-ECO-orf4的构建 | 第69-71页 |
| ·蛋白ECO-orf4在大肠杆菌中的表达 | 第71页 |
| ·蛋白ECO-orf4的表达优化 | 第71-74页 |
| ·本章小结 | 第74-75页 |
| 第4章 ECO-orf27基因功能的研究 | 第75-90页 |
| ·引言 | 第75页 |
| ·试验材料 | 第75-76页 |
| ·菌种及质粒 | 第75-76页 |
| ·试验试剂 | 第76页 |
| ·培养基 | 第76页 |
| ·主要溶液 | 第76页 |
| ·试验仪器 | 第76页 |
| ·试验方法 | 第76-78页 |
| ·PCR反应 | 第77-78页 |
| ·目的产物的HPLC检测 | 第78页 |
| ·结果与讨论 | 第78-89页 |
| ·ECO-orf27生物信息学分析 | 第78页 |
| ·ECO-orf27敲除质粒pLYSY27的构建 | 第78-79页 |
| ·ECO-orf27缺失突变株的筛选 | 第79-83页 |
| ·ECO-orf27缺失突变株的发酵验证 | 第83页 |
| ·ECO-orf27互补质粒的构建 | 第83-85页 |
| ·ECO-orf27互补突变株及交叉互补突变株的筛选 | 第85页 |
| ·ECO-orf27互补突变株及交叉互补突变株的发酵验证 | 第85-86页 |
| ·TE Ⅱ过表达质粒的构建 | 第86页 |
| ·TE Ⅱ过表达工程菌的筛选 | 第86页 |
| ·TE Ⅱ过表达工程菌的发酵验证 | 第86-89页 |
| ·本章小结 | 第89-90页 |
| 第5章 产去甲基ECO-0501工程菌的构建 | 第90-101页 |
| ·引言 | 第90页 |
| ·试验材料 | 第90-91页 |
| ·菌种及质粒 | 第90-91页 |
| ·试验试剂 | 第91页 |
| ·培养基 | 第91页 |
| ·主要溶液 | 第91页 |
| ·试验仪器 | 第91页 |
| ·试验方法 | 第91-92页 |
| ·PCR反应 | 第91页 |
| ·目的产物的HPLC检测 | 第91-92页 |
| ·结果与讨论 | 第92-100页 |
| ·ECO-orf5上下游序列的克隆 | 第92页 |
| ·ECO-orf5敲除质粒的构建 | 第92页 |
| ·ECO-orf5敲除突变株的筛选 | 第92-98页 |
| ·ECO-orf5敲除突变株的发酵验证 | 第98-100页 |
| ·本章小结 | 第100-101页 |
| 第6章 结论与展望 | 第101-103页 |
| ·结论 | 第101页 |
| ·展望 | 第101-103页 |
| 参考文献 | 第103-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 博士期间发表的论文 | 第116-117页 |
| 附录一 | 第117页 |
