| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-11页 |
| Abstract | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-37页 |
| 1.基因表达调控的基本理论 | 第15-25页 |
| ·染色质在核内的空间构象是基因表达调控的一个重要层面 | 第16-18页 |
| ·核基质在染色质空间构象组织中的作用 | 第18-25页 |
| ·核基质的基本理论 | 第18-19页 |
| ·核基质结合区(MAR) | 第19-20页 |
| ·MAR结合蛋白 | 第20-21页 |
| ·SATB1的结构特征以及在基因表达调控中的作用研究 | 第21-25页 |
| ·SATB1可以通过介导核基质结合而调控相关基因表达 | 第23-24页 |
| ·SATB1参与染色质环的Base的形成 | 第24-25页 |
| 2.Beta-globin基因簇的染色质结构模式研究与核基质等的关系 | 第25-31页 |
| ·珠蛋白基因簇的表达受DNA、染色质和核定位三个水平的综合调控 | 第25-30页 |
| ·珠蛋白基因簇在DNA水平上的调控 | 第25-27页 |
| ·珠蛋白基因簇在染色质水平上的调控 | 第27-29页 |
| ·β珠蛋白基因簇在核水平上的调控 | 第29-30页 |
| ·珠蛋白基因簇表达调控研究的新领域 | 第30-31页 |
| ·核基质参与珠蛋白基因簇表达调控 | 第30页 |
| ·SATB1可在染色质水平和核水平上调控β珠蛋白基因的表达 | 第30-31页 |
| 3.细胞分裂中真核基因表达的保持与核基质蛋白结合保留的关系 | 第31-35页 |
| ·顺式记忆元件和相关蛋白复合物 | 第31-32页 |
| ·表观记忆信号 | 第32-33页 |
| ·有丝分裂染色质失活时多种组蛋白修饰的保留记忆了基因的转录状态 | 第33页 |
| ·特异转录因子在转录记忆中可能的作用 | 第33-35页 |
| 4.本课题研究的理论问题与实验设计 | 第35-37页 |
| 材料与方法 | 第37-57页 |
| 一.实验材料 | 第37-38页 |
| 1.细胞系 | 第37页 |
| 2.交联试剂 | 第37页 |
| 3.有丝分裂同步化试剂 | 第37页 |
| 4.蛋白酶抑制剂 | 第37页 |
| 5.限制性内切酶及其他修饰酶 | 第37页 |
| 6.抗体 | 第37页 |
| 7.主要试剂 | 第37-38页 |
| 8.引物合成 | 第38页 |
| 9.主要仪器设备 | 第38页 |
| 二.实验方法 | 第38-57页 |
| 1.本研究的基本技术路线 | 第38-40页 |
| 2.细胞培养 | 第40页 |
| ·K562细胞生长条件 | 第40页 |
| ·K562细胞传代 | 第40页 |
| ·K562细胞的复苏和冻存 | 第40页 |
| 3.染色质构象定量分析技术 | 第40-44页 |
| ·染色质构象定量分析(3C)的技术流程 | 第40-43页 |
| ·交联固定的细胞核的制备 | 第40-41页 |
| ·细胞裂解与细胞核的分离 | 第41页 |
| ·台盼蓝染色检测细胞裂解情况 | 第41页 |
| ·非特异结合蛋白的洗脱与SDS的中和 | 第41页 |
| ·细胞核的保存 | 第41页 |
| ·细胞核内染色质DNA的限制性内切酶消化与鉴定 | 第41-42页 |
| ·细胞核的限制性内切酶消化 | 第41-42页 |
| ·限制性内切酶消化效率的鉴定 | 第42页 |
| ·交联固定的染色质复合物内DNA分子的连接 | 第42页 |
| ·细胞核的裂解与SDS的中和 | 第42页 |
| ·染色质复合物内DNA分子的连接 | 第42页 |
| ·连接产物DNA的制备与定量 | 第42-43页 |
| ·染色质复合物的解交联 | 第42页 |
| ·DNA片段的纯化、回收与定量 | 第42-43页 |
| ·连接产物DNA线性扩增范围的确定 | 第43页 |
| ·相邻染色质捕获技术(QACT) | 第43-44页 |
| ·3C模板DNA的第二步酶消化 | 第43页 |
| ·反向PCR(Inverse PCR) | 第43-44页 |
| ·PCR产物的直接测序 | 第44页 |
| ·串联体测序 | 第44页 |
| ·接头替换 | 第44页 |
| ·Tags制备 | 第44页 |
| ·串联体制备,回收及克隆 | 第44页 |
| 4.凝胶电泳阻滞实验分析 | 第44-48页 |
| ·细胞核蛋白提取 | 第44-46页 |
| ·探针退火 | 第46页 |
| ·探针的标记 | 第46-47页 |
| ·凝胶迁移实验 | 第47-48页 |
| 5.Western Blot分析 | 第48-51页 |
| ·裂解细胞 | 第48页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第48-49页 |
| ·BCA法测定蛋白质浓度的实验原理 | 第48-49页 |
| ·实验步骤 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE | 第49-50页 |
| ·转膜 | 第50页 |
| ·抗原抗体反应 | 第50页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法 | 第50-51页 |
| 6.染色质免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP) | 第51-53页 |
| ·固定细胞 | 第51页 |
| ·全细胞抽提物(whole-cell extract,WCE)的获得 | 第51-52页 |
| ·免疫沉淀 | 第52页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第52页 |
| ·PCR定量分析 | 第52-53页 |
| 7.染色质免疫共沉淀与3C方法的联合(ChIP-3C) | 第53页 |
| 8.免疫共沉淀(immunoprecipitation IP)检测蛋白相互作用以及蛋白质的翻译后修饰情况 | 第53页 |
| 9.细胞周期同步化 | 第53-55页 |
| ·细胞周期同步化试剂Nocodazole的配置 | 第53-54页 |
| ·用Nocodazole处理将哺乳动物细胞同步化到有丝分裂期 | 第54页 |
| ·流式细胞仪测定细胞DNA含量确定同步化效果 | 第54-55页 |
| ·收集细胞 | 第54页 |
| ·PI染色法测定细胞周期 | 第54-55页 |
| 10.免疫荧光观察有丝分裂时组蛋白修饰和转录因子在染色体上的保留情况 | 第55-57页 |
| ·多聚甲醛固定 | 第55页 |
| ·低渗处理 | 第55页 |
| ·封闭 | 第55页 |
| ·一抗孵育 | 第55页 |
| ·二抗孵育 | 第55-56页 |
| ·DAPI或PI染色 | 第56页 |
| ·封片 | 第56页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察记录 | 第56-57页 |
| 实验结果 | 第57-85页 |
| 1.利用定量的空间相邻染色质捕获技术搜索空间上相互作用的SATB1结合片段 | 第57-66页 |
| ·3C模板的制备 | 第57-60页 |
| ·半定量以及realtime PCR鉴定酶切效率在不同位点的一致性 | 第57-59页 |
| ·PCR检测3C模板DNA的质量 | 第59-60页 |
| ·利用QACT技术以已知的SATB1结合序列—HS2 MAR为引领片段捕获β-globin基因簇内可能的空间上相互作用的片段 | 第60-61页 |
| ·β-globin基因簇内捕获片段的统计和分析 | 第61-66页 |
| 2.捕获的远距离作用片段(MARs元件)的验证 | 第66-69页 |
| ·利用普通3C验证β-globin基因簇内潜在MARs元件的空间作用关系以及在Hemin诱导K562细胞分化后这些元件相互作用的变化情况 | 第66-68页 |
| ·β-globin基因簇内捕获MARs的SATB1结合情况分析 | 第68-69页 |
| 3.利用免疫共沉淀和染色质构象捕获技术联合(ChIP-3C)分析SATB1是否介导β-globin基因簇内上述特异MARs之间的相互作用 | 第69-71页 |
| 4.SATB1的乙酰化修饰对基因表达调控的影响 | 第71-73页 |
| ·SATB1在正常和Hemin诱导的K562细胞中的表达分析 | 第71页 |
| ·SATB1在诱导前后的K562细胞中的乙酰化修饰的变化 | 第71-72页 |
| ·突变SATB1的乙酰化位点后分析β珠蛋白基因的表达情况 | 第72-73页 |
| 5.利用RNA干扰技术下调SATB1表达后对β-globin基因表达及染色质活性结构的影响 | 第73-80页 |
| ·SATB1干扰的鉴定 | 第73-74页 |
| ·SATB1干扰的细胞中α,β,γ,ζ,ε基因的表达变化情况 | 第74-75页 |
| ·SATB1干扰的细胞中红系特异转录因子的表达变化情况 | 第75-76页 |
| ·SATB1干扰的细胞中染色质空间结构的变化情况 | 第76-80页 |
| ·SATB1干扰后MARs位点与SATBI的结合情况分析 | 第76-77页 |
| ·SATB1干扰后相关MARs之间相互作用情况分析以及基因启动子和调控区所在的染色质片段的相互作用情况分析 | 第77-80页 |
| 6.SATB1在细胞分裂期染色体上的结合保留分析 | 第80-85页 |
| ·利用免疫荧光检测细胞周期不同时相SATB1在MARs区的结合变化情况 | 第81-82页 |
| ·利用染色质免疫共沉淀检测细胞周期不同时相SATB1在MARs区的结合变化情况 | 第82-84页 |
| ·利用GFP-SATB1融合蛋白原位检测细胞周期不同时相SATB1在MARs区的结合变化情况 | 第84-85页 |
| 讨论 | 第85-100页 |
| 本研究概述 | 第85页 |
| 1.核基质对于基因表达的调控作用 | 第85-87页 |
| 2.Beta-珠蛋白的表达与核基质的关系 | 第87-89页 |
| 3.Beta珠蛋白表达时的染色质空间相互作用 | 第89-90页 |
| 4.Beta珠蛋白基因簇内的MARs区域的空间相互作用及其对活性染色质构象的作用 | 第90-93页 |
| 5.SATB1参与beta一类珠蛋白的表达调控 | 第93-95页 |
| ·SATB1蛋白的结构特征以及在其它基因表达调控中的作用 | 第93页 |
| ·SATB1蛋白参与beta—类珠蛋白基因的表达调控 | 第93-95页 |
| 6.SATB1蛋白对于beta类珠蛋白类基因,特别是epsiion基因的表达是必须的 | 第95-96页 |
| 7.SATB1蛋白乙酰化修饰在hemin诱导分化前后的K562细胞中的变化 | 第96-98页 |
| ·SATB1被报道有翻译后修饰包括乙酰化和磷酸化 | 第96-97页 |
| ·在K562细胞中SATB1存在乙酰化修饰并且诱导分化后乙酰化水平下降 | 第97-98页 |
| 8.SATB1与MARs结合的记忆保留机制 | 第98-99页 |
| 9.本研究的不足与展望 | 第99页 |
| 10.本研究的创新点 | 第99-100页 |
| 小结 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-109页 |
| 论文综述 | 第109-123页 |
| 英文名词及缩写 | 第123-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 个人简历 | 第126-128页 |
