| 独创声明 | 第1页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第3-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 1 前言 | 第13-36页 |
| ·世界和中国水产养殖概况 | 第13页 |
| ·鱼类的细菌性病害 | 第13-15页 |
| ·病原弧菌的致病因子 | 第15-24页 |
| ·粘附相关因子 | 第15页 |
| ·毒性质粒及铁吸收系统 | 第15-16页 |
| ·胞外蛋白酶 | 第16-17页 |
| ·脂多糖 | 第17页 |
| ·磷脂酶 | 第17-19页 |
| ·溶血素 | 第19-24页 |
| ·TDH 及其相关溶血素 | 第21-22页 |
| ·HlyA 及其相关溶血素 | 第22-23页 |
| ·TLH 及其相关溶血素 | 第23页 |
| ·δ-VPH 及其相关溶血素 | 第23-24页 |
| ·哈维氏弧菌 | 第24-30页 |
| ·哈维氏弧菌（=鲨鱼弧菌）的生物学特性 | 第24-27页 |
| ·哈维氏弧菌（=鲨鱼弧菌）的流行病学 | 第27-29页 |
| ·哈维氏弧菌的致病机制 | 第29-30页 |
| ·大肠杆菌中重组蛋白的分泌 | 第30-34页 |
| ·I 型分泌系统 | 第30-31页 |
| ·II 型分泌系统 | 第31-34页 |
| ·SecB 依赖途径 | 第31-33页 |
| ·SRP 途径 | 第33页 |
| ·TAT 途径 | 第33-34页 |
| ·本论文研究的目的和意义 | 第34-36页 |
| 2 材料与方法 | 第36-54页 |
| ·菌株和质粒 | 第36-37页 |
| ·实验动物和细胞系 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37-38页 |
| ·试剂和仪器 | 第38-39页 |
| ·溶血素基因vhhA 的表达 | 第39-43页 |
| ·pET-24d（+）/vhhA 表达质粒的构建及鉴定 | 第39-42页 |
| ·引物设计及合成 | 第39页 |
| ·质粒DNA 提取 | 第39-40页 |
| ·溶血素基因vhhA 的PCR 扩增 | 第40页 |
| ·扩增产物的检测及纯化 | 第40页 |
| ·pET-24d（+）/vhhA 表达质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第41-42页 |
| ·pET-24d（+）/vhhA 表达质粒的转化 | 第42页 |
| ·pET-24d（+）/vhhA 表达质粒的鉴定 | 第42页 |
| ·溶血素基因vhhA 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 | 第42-43页 |
| ·溶血素基因vhhA 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达 | 第42页 |
| ·溶血素基因vhhA 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测 | 第42-43页 |
| ·溶血素基因vhhA 表达条件的优化 | 第43页 |
| ·重组菌BL21(DE3)/pET-24d(+)/vhhA 的溶血试验 | 第43页 |
| ·VHH 溶血素重组蛋白的纯化 | 第43-45页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24d(+)/vhhA 的诱导及培养 | 第43页 |
| ·从菌体中纯化VHH 溶血素 | 第43页 |
| ·从培养上清液中纯化VHH 溶血素 | 第43-44页 |
| ·从包涵体中纯化VHH 溶血素 | 第44页 |
| ·Ni 柱亲和层析 | 第44页 |
| ·Ni 亲和柱的处理与再生 | 第44-45页 |
| ·VHH 溶血素的性质研究 | 第45-47页 |
| ·分泌到上清液中的VHH 溶血素的分子量测定 | 第45页 |
| ·分泌到上清液中的VHH 溶血素的N-末端氨基酸序列的测定 | 第45页 |
| ·溶血活力测定方法 | 第45-46页 |
| ·温度对溶血活力的影响 | 第46页 |
| ·pH 对溶血活力的影响 | 第46页 |
| ·金属离子对溶血活力的影响 | 第46页 |
| ·VHH 溶血素的磷脂酶和脂酶活性测定 | 第46页 |
| ·薄层层析（TLC） | 第46-47页 |
| ·VHH 溶血素的细胞毒性及致病性 | 第47-48页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆鳃细胞系（FG）的细胞毒性 | 第47页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆的致病性及组织病理学研究 | 第47-48页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆的致病性 | 第47页 |
| ·组织病理学研究 | 第47-48页 |
| ·Western blotting | 第48-49页 |
| ·抗VHH 溶血素多克隆抗体的制备 | 第48页 |
| ·交叉反应的去除 | 第48页 |
| ·哈维氏弧菌VIB 645 胞外产物（ECP）的分离 | 第48页 |
| ·Western blotting 分析哈维氏弧菌VIB 645 的胞外产物 | 第48-49页 |
| ·Southern blotting | 第49-54页 |
| ·弧菌DNA 的提取 | 第49-50页 |
| ·探针引物设计及合成 | 第50-51页 |
| ·地高辛（DIG）标记的vhh 溶血素基因探针的合成 | 第51-52页 |
| ·Southern blotting 分析vhh 溶血素基因在不同哈维氏弧菌菌株中的分布 | 第52-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-72页 |
| ·溶血素基因vhhA 的表达 | 第54-58页 |
| ·pET-24d（+）/vhhA 表达质粒的构建及鉴定 | 第54页 |
| ·溶血素基因vhhA 的表达 | 第54-55页 |
| ·表达条件的优化 | 第55-57页 |
| ·重组菌BL21(DE3)/pET-24d(+)/vhhA 的溶血试验 | 第57-58页 |
| ·重组蛋白VHH 溶血素的纯化 | 第58-60页 |
| ·从菌体中纯化VHH 溶血素 | 第58-60页 |
| ·从上清液中纯化VHH 溶血素 | 第60页 |
| ·从包涵体中纯化VHH 溶血素 | 第60页 |
| ·VHH 溶血素的性质研究 | 第60-65页 |
| ·分泌到上清液中的VHH 溶血素的分子量测定 | 第60页 |
| ·分泌到上清液中的VHH 溶血素的N 末端序列 | 第60-63页 |
| ·温度对溶血活力的影响 | 第63页 |
| ·pH 对溶血活力的影响 | 第63页 |
| ·金属离子对溶血活力的影响 | 第63-64页 |
| ·VHH 溶血素的磷脂酶和脂酶活性的测定 | 第64-65页 |
| ·薄层层析（TLC） | 第65页 |
| ·VHH 溶血素的细胞毒性及致病性 | 第65-68页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆鳃细胞系（FG）的细胞毒作用 | 第65-66页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆的致病性和组织病理学研究 | 第66-68页 |
| ·VHH 溶血素对牙鲆的致病性 | 第66-67页 |
| ·组织病理学研究 | 第67-68页 |
| ·Western blotting | 第68-69页 |
| ·VHH 溶血素抗血清的制备与效价 | 第68页 |
| ·Western blotting 检测哈维氏弧菌VIB 645 胞外产物中的溶血素 | 第68-69页 |
| ·Southern blotting | 第69-72页 |
| ·地高辛（DIG）标记的vhh 溶血素基因探针的合成 | 第69-70页 |
| ·Southern blotting 分析vhh 溶血素基因在不同哈维氏弧菌菌株中的分布 | 第70-72页 |
| 4 讨论 | 第72-77页 |
| 5 小结 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-90页 |
| 附录I 溶液配方 | 第90-93页 |
| 附录II 序列比对结果 | 第93-99页 |
| 附录III VHH 溶血素N-端测序图 | 第99-101页 |
| 附录IV 发表和撰写的文章 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
