| 前言 | 第1-22页 |
| 1、RNA干涉简介 | 第8-17页 |
| 1．1、RNA干涉的发展史 | 第8页 |
| 1．2、RNA干涉机制的模型 | 第8-13页 |
| 1．2．1、siRNA的生成 | 第9-12页 |
| 1．2．1．1、dsRNA转变成siRNA | 第9-10页 |
| 1．2．1．2、siRNA的放大效应 | 第10-12页 |
| 1．2．1．2．1、次级dsRNA的生成 | 第11-12页 |
| 1．2．1．2．2、次级siRNA信号传递 | 第12页 |
| 1．2．2、mRNA的降解 | 第12-13页 |
| 1．3、RNA干涉的应用 | 第13-17页 |
| 1．3．1、在基因功能研究中的应用 | 第13-14页 |
| 1．3．2、在疾病治疗研究中的应用 | 第14-15页 |
| 1．3．3、在干细胞研究中的应用 | 第15-16页 |
| 1．3．4、在植物抗病毒研究中的应用 | 第16-17页 |
| 2、四方表格x~2检验简介 | 第17-19页 |
| 3、课题意义 | 第19-22页 |
| 3．1、课题背景 | 第19页 |
| 3．2、实验思路 | 第19-20页 |
| 3．3、课题意义 | 第20-22页 |
| 实验技术路线 | 第22-23页 |
| 实验部分 | 第23-51页 |
| 1、实验材料和仪器 | 第23-27页 |
| 1．1、实验所用数据库及工具 | 第23页 |
| 1．2、实验材料 | 第23-25页 |
| 1．2．1、菌株、质粒、引物 | 第23-24页 |
| 1．2．2、工具酶和主要试剂 | 第24页 |
| 1．2．3、常用试剂、培养基及母液的配制 | 第24-25页 |
| 1．3、主要仪器 | 第25-27页 |
| 2、实验方法 | 第27-41页 |
| 2．1、已发表siRNA序列及21bp随机片段数据整理 | 第27页 |
| 2．2、利用MicrosoftExcel软件对siRNA分子特性进行四格表x~2检验 | 第27页 |
| 2．3、设计人巨细胞病毒UL49基因的候选siRNA序列 | 第27-28页 |
| 2．4、以统计学的结果初步筛选UL49基因候选siRNA序列 | 第28-29页 |
| 2．5、构建pMD18-shRNA表达质粒 | 第29-34页 |
| 2．5．1、PCR扩增siRNA表达片段(siRNAexpressioncassettes，SECs) | 第29-30页 |
| 2．5．2、PCR产物的纯化 | 第30-31页 |
| 2．5．3、TA克隆构建pMD18-shRNA表达质粒 | 第31-34页 |
| 2．5．3．1、制备感受态细菌 | 第31-32页 |
| 2．5．3．2、DNA重组 | 第32页 |
| 2．5．3．3、重组DNA转化宿主菌 | 第32页 |
| 2．5．3．4、pMD18-shRNA重组质粒抽提 | 第32-33页 |
| 2．5．3．5、pMD18-shRNA重组质粒的PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 2．5．3．6、pMD18-shRNA重组质粒BamHI和HindIII双酶切鉴定 | 第34页 |
| 2．6、pEGFP-UL49绿色荧光蛋白融合质粒的构建 | 第34-38页 |
| 2．6．1、PCR扩增UL49基因 | 第34-35页 |
| 2．6．2、纯化UL49基因片段 | 第35页 |
| 2．6．3、pEGFP-N1质粒抽提 | 第35页 |
| 2．6．4、双酶切处理UL49基因片段及pEGFP-N1载体 | 第35-36页 |
| 2．6．5、构建pEGFP-UL49质粒 | 第36页 |
| 2．6．6、重组子转化及鉴定 | 第36-38页 |
| 2．6．6．1、制备感受态细胞 | 第36页 |
| 2．6．6．2、重组DNA转化 | 第36-37页 |
| 2．6．6．3、扩大培养阳性克隆菌落并抽提质粒 | 第37页 |
| 2．6．6．4、重组质粒的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2．6．6．5、重组质粒的双酶切鉴定 | 第38页 |
| 2．6．6．6、重组质粒测序 | 第38页 |
| 2．7、UL49基因mRNA的RNA干涉实验 | 第38-41页 |
| 2．7．1、HeLa细胞培养 | 第39页 |
| 2．7．1．1、Hela细胞的传代培养 | 第39页 |
| 2．7．1．1．1、培养器皿的准备 | 第39页 |
| 2．7．1．1．2、Hela细胞的传代 | 第39页 |
| 2．7．2、pMD18-shRNA质粒和pEGFP-UL49质粒的制备 | 第39页 |
| 2．7．3、pMD18-shRNA质粒和pEGFP-ULA9质粒共转染实验 | 第39-41页 |
| 3、实验结果 | 第41-51页 |
| 3．1、siRNA分子各位点的碱基频率分析结果 | 第41-42页 |
| 3．2、siRNA分子两端G／C含量比较结果 | 第42页 |
| 3．3、x~2检验分析siRNA分子特性结果 | 第42-44页 |
| 3．3．1、siRNA分子各位点碱基偏好性x~2检验结果 | 第43页 |
| 3．3．2、siRNA分子两端G／C含量差异性x~2分析结果 | 第43页 |
| 3．3．3、siRNA分子Tm值特点 | 第43-44页 |
| 3．4、pMD18-shRNA表达质粒构建结果 | 第44-47页 |
| 3．4．1、PCR扩增SECs的结果 | 第45-46页 |
| 3．4．2、pMD18-shRNA质粒PCR和双酶切鉴定结果 | 第46-47页 |
| 3．4．3、pMD18-shRNA质粒测序结果 | 第47页 |
| 3．5、pEGFP-UL49融合质粒构建结果 | 第47-49页 |
| 3．5．1、PCR扩增UL49基因结果 | 第47-48页 |
| 3．5．2、pEGFP-UL49阳性质粒PCR鉴定及BamHI、HindIII双酶切鉴定结果 | 第48-49页 |
| 3．5．3、pEGFP-UL49阳性质粒测序结果 | 第49页 |
| 3．6、RNA干涉UL49基因表达结果 | 第49-51页 |
| 讨论 | 第51-60页 |
| 1、统计学与分子生物学研究 | 第51页 |
| 2、siRNA分子特性与RNA干涉机制之间的关系 | 第51-57页 |
| 2．1、siRNA分子第3、4、6位点G／C碱基偏好与Dicer酶dsRBD结构域 | 第52-54页 |
| 2．2、siRNA分子第1、2、20、21位点A／T碱基偏好性与PAZ结构域 | 第54-55页 |
| 2．3、siRNA分子特性与其在RISC中的功能 | 第55页 |
| 2．4、siRNA分子特性与RNA解旋酶 | 第55-56页 |
| 2．5、siRNA分子特性与RNA依赖的RNA聚合酶的关系 | 第56-57页 |
| 3、RNA干涉UL49基因的表达 | 第57-60页 |
| 3．1、pMD18-shRNA质粒的构建 | 第58页 |
| 3．2、RNA干涉实验快速检测方法的建立 | 第58-60页 |
| 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 附录 | 第65-80页 |
| 附录Ⅰ 已发表的siRNA序列信息及文献来源 | 第65-73页 |
| 附录Ⅱ 21bp随机片段序列 | 第73-74页 |
| 附录Ⅲ Ambion公司设计UL49基因的候选siRNA序列结果 | 第74-77页 |
| 附录Ⅳ pMD18-TVector背景资料 | 第77页 |
| 附录Ⅴ pEGFP-N1背景资料 | 第77-78页 |
| 附录Ⅵ pMD18-shRNA质粒测序结果 | 第78-79页 |
| 附录Ⅶ pEGFP-UL49质粒测序结果 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
