| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-28页 |
| 1．1 PCR简史 | 第9页 |
| 1．2 Taq DNA聚合酶的发现及特性 | 第9-13页 |
| 1．2．1 Taq DNA聚合酶的发现 | 第9-11页 |
| 1．2．2 酶活性与热稳定性 | 第11页 |
| 1．2．3 酶的离子依赖性 | 第11-12页 |
| 1．2．4 酶的忠实性 | 第12-13页 |
| 1．2．5 抑制剂 | 第13页 |
| 1．3 外源蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第13-16页 |
| 1．3．1 重组表达载体启动子的选择 | 第14页 |
| 1．3．2 酶生物合成的诱导表达 | 第14-15页 |
| 1．3．3 外源蛋白在宿主大肠杆菌细胞中的折叠和降解 | 第15页 |
| 1．3．4 宿主菌的培养控制 | 第15页 |
| 1．3．5 表达条件的选择 | 第15-16页 |
| 1．4 大肠杆菌的破碎方法 | 第16-17页 |
| 1．4．1 组织捣碎和匀浆器匀浆 | 第16页 |
| 1．4．2 超声波处理法 | 第16页 |
| 1．4．3 反复冻融法 | 第16页 |
| 1．4．4 化学处理法 | 第16-17页 |
| 1．5 蛋白质的分离纯化 | 第17-23页 |
| 1．5．1 蛋白质(包括酶)的提取 | 第17-18页 |
| 1．5．1．1 水溶液提取法 | 第17-18页 |
| 1．5．1．2 有机溶剂提取法 | 第18页 |
| 1．5．1．3 抽提液的一些条件 | 第18页 |
| 1．5．2 蛋白质的分离纯化方法 | 第18-21页 |
| 1．5．2．1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 | 第18-20页 |
| 1．5．2．2 根据蛋白质分子大小差别的分离方法 | 第20页 |
| 1．5．2．3 根据蛋白质带电性质进行分离 | 第20-21页 |
| 1．5．2．4 根据配体特异性的分离方法一亲和色谱法 | 第21页 |
| 1．5．3 分离纯化对蛋白质活性的影响 | 第21-23页 |
| 1．5．3．1 蛋白质结构对对活性的影响 | 第21页 |
| 1．5．3．2 纯化条件对蛋白质活性的影响 | 第21-23页 |
| 1．6 蛋白质的纯度鉴定方法 | 第23页 |
| 1．7 蛋白质的分子量测定方法 | 第23-24页 |
| 1．7．1 根据化学组成测定最低蛋白质的相对分子量 | 第23页 |
| 1．7．2 渗透压法的测定相对分子量 | 第23-24页 |
| 1．7．3 沉降分析法测定相对分子量 | 第24页 |
| 1．7．4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量 | 第24页 |
| 1．8 蛋白质含量的测定方法 | 第24页 |
| 1．9 Taq DNA聚合酶的研究进展 | 第24-28页 |
| 2 材料和方法 | 第28-39页 |
| 2．1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2．1．1 植物材料 | 第28页 |
| 2．1．2 菌株和质粒 | 第28页 |
| 2．1．3 重要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2．1．4 重要的生化试剂 | 第29页 |
| 2．2 方法 | 第29-39页 |
| 2．2．1 Taq DNA聚合酶表达载体构建 | 第29-30页 |
| 2．2．2 蛋白表达的大肠杆菌宿主 | 第30-31页 |
| 2．2．2．1 大肠杆菌工程菌菌株的培养与保存 | 第30页 |
| 2．2．2．2 大肠杆菌热激感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2．2．2．3 大肠杆菌电击感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2．2．3 重组质粒pTaq的电击转化和热激转化 | 第31-32页 |
| 2．2．4 重组质粒pTrc99A的提取与保存 | 第32页 |
| 2．2．4．1 质粒的提取 | 第32页 |
| 2．2．4．2 重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第32页 |
| 2．2．5 Taq DNA聚合酶基因的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2．2．6 Taq DNA聚合酶的提取纯化 | 第33页 |
| 2．2．7 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq DNA聚合酶分子量及纯度 | 第33-35页 |
| 2．2．7．1 聚丙烯酰胺凝胶的制作 | 第34-35页 |
| 2．2．7．2 电泳 | 第35页 |
| 2．2．7．3 凝胶的染色和脱色 | 第35页 |
| 2．2．8 Taq DNA聚合酶活力检测及酶活单位标定 | 第35-37页 |
| 2．2．8．1 酶活单位测定 | 第35-36页 |
| 2．2．8．2 蛋白含量的测定—考马斯亮蓝结合法 | 第36页 |
| 2．2．8．3 自制Taq DNA聚合酶与市售商品酶的比较 | 第36-37页 |
| 2．2．9 自制Taq DNA聚合酶在不同PCR系统中的应用 | 第37-39页 |
| 2．2．9．1 玉米/真菌基因组总DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2．2．9．2 玉米/真菌基因组RAPD分析 | 第38页 |
| 2．2．9．3 玉米基因组SSR分析 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-44页 |
| 3．1 工程菌菌株对Taq DNA聚合酶基因表达的影响 | 第39页 |
| 3．2 电击转化与热激转化的比较 | 第39-40页 |
| 3．3 诱导时间和诱导物浓度对酶基因表达和酶活性的影响 | 第40-41页 |
| 3．4 硫酸铵对酶蛋白的沉淀 | 第41页 |
| 3．5 优化技术制备的Taq DNA聚合酶与市售商品酶的比较 | 第41-43页 |
| 3．6 自制酶在PCR系统的应用 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-47页 |
| 4．1 提高转化效率的几个重要因素 | 第44-45页 |
| 4．1．1 细胞生长状态和密度 | 第44页 |
| 4．1．2 质粒的质量和浓度 | 第44页 |
| 4．1．3 防止杂菌和杂DNA的污染 | 第44-45页 |
| 4．2 菌株对酶的表达影响 | 第45页 |
| 4．3 诱导时间和诱导物浓度对酶表达量的影响 | 第45页 |
| 4．4 其他影响因素 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 附录 | 第50-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 论文发表情况 | 第54页 |
