| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 符号及缩略词说明 | 第13-16页 |
| 第一部分 马铃薯Y病毒外壳蛋白基因整合方式与抗病性的关系及抗性传导规律 | 第16-69页 |
| 1 引言 | 第16-38页 |
| 1．1 转录后基因沉默 | 第16-30页 |
| 1．1．1 转录后基因沉默在生物界存在的普遍性 | 第16-19页 |
| 1．1．2 参与转录后基因沉默的细胞组分 | 第19-22页 |
| 1．1．3 转录后基因沉默与甲基化 | 第22页 |
| 1．1．4 转录后基因沉默的作用机制 | 第22-23页 |
| 1．1．5 转录后基因沉默的传导和信号分子 | 第23-26页 |
| 1．1．6 转录后基因沉默的抑制 | 第26-28页 |
| 1．1．7 转录后基因沉默的发展和应用 | 第28-30页 |
| 1．2 转录后基因沉默与植物的RNA介导病毒抗性 | 第30-34页 |
| 1．2．1 RNA介导病毒抗性的特点 | 第31页 |
| 1．2．2 RNA介导抗性属于转录后基因沉默 | 第31-32页 |
| 1．2．3 关于RNA介导抗性的假说 | 第32-34页 |
| 1．3 本研究的立论依据和主要研究内容 | 第34-38页 |
| 2 材料与方法 | 第38-47页 |
| 2．1 材料 | 第38页 |
| 2．1．1 毒源 | 第38页 |
| 2．1．2 供试植物材料背景 | 第38页 |
| 2．1．3 PCR引物 | 第38页 |
| 2．1．4 菌种质粒 | 第38页 |
| 2．1．5 常用缓冲液及培养基的配制 | 第38页 |
| 2．2 方法 | 第38-47页 |
| 2．2．1 转基因烟草的组培扩繁 | 第38-39页 |
| 2．2．2 卡那霉素抗性筛选 | 第39页 |
| 2．2．3 ELISA检测 | 第39页 |
| 2．2．4 PCR检测 | 第39页 |
| 2．2．5 嫁接 | 第39页 |
| 2．2．6 农杆菌渗入法 | 第39-40页 |
| 2．2．7 质粒DNA的提取 | 第40-42页 |
| 2．2．7．1 质粒DNA的微量提取 | 第40页 |
| 2．2．7．2 质粒DNA的大量提取 | 第40-42页 |
| 2．2．8 植物总DNA的提取及Southern blot分析 | 第42-44页 |
| 2．2．8．1 植物总DNA的提取 | 第42页 |
| 2．2．8．2 DNA凝胶电泳 | 第42页 |
| 2．2．8．3 转膜 | 第42-43页 |
| 2．2．8．4 探针的制备 | 第43-44页 |
| 2．2．8．5 杂交 | 第44页 |
| 2．2．9 植物总RNA的提取及Northern blot分析 | 第44-47页 |
| 2．2．9．1 植物总RNA的提取 | 第44-45页 |
| 2．2．9．2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳 | 第45页 |
| 2．2．9．3 转膜 | 第45-46页 |
| 2．2．9．4 探针制备 | 第46页 |
| 2．2．9．5 杂交 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-63页 |
| 3．1 转非翻译PVYCP基因T1代植株的获得及鉴定 | 第47-51页 |
| 3．1．1 转非翻译PVYCP基因烟草T1代植株的获得 | 第47页 |
| 3．1．2 转非翻译PVYCP基因T1代植株的鉴定 | 第47-51页 |
| 3．1．2．1 卡那抗性鉴定 | 第47-49页 |
| 3．1．2．2 抗病性鉴定 | 第49-50页 |
| 3．1．2．3 PCR检测 | 第50-51页 |
| 3．2 转基因mRNA表达与抗病性的关系 | 第51-52页 |
| 3．3 转基因整合方式与抗病性的关系 | 第52-58页 |
| 3．3．1 转基因烟草基因组DNA提取和酶切 | 第52-53页 |
| 3．3．2 转基因的拷贝数与抗病性 | 第53-54页 |
| 3．3．3 转基因的整合方式与抗病性 | 第54-58页 |
| 3．4 高度抗病株系T1代抗病性表现的稳定性 | 第58-59页 |
| 3．5 RNA介导病毒抗性的传导 | 第59-62页 |
| 3．5．1 利用单嫁接研究RNA介导抗性在不同抗病型植株间的传导 | 第59-61页 |
| 3．5．2 双嫁接研究病毒在RNA介导的抗性植株中的传播 | 第61-62页 |
| 3．6 农杆菌渗入法介导抗性 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-68页 |
| 4．1 关于转基因的拷贝数 | 第63页 |
| 4．2 转基因的拷贝数与RNA介导抗性 | 第63-64页 |
| 4．3 转基因的整合方式与RNA介导抗性 | 第64-65页 |
| 4．4 高度抗病株系T1代抗性及遗传稳定性 | 第65页 |
| 4．5 RNA介导抗性的传导 | 第65-66页 |
| 4．6 病毒在RNA介导的高度抗病植株内的传输 | 第66-67页 |
| 4．7 农杆菌渗入法介导病毒抗性 | 第67-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 第二部分 马铃薯X病毒25KD运动蛋白基因的克隆及表达载体的构建 | 第69-91页 |
| 1 引言 | 第69-74页 |
| 1．1 植物病毒运动蛋白的类型及作用机制 | 第69-71页 |
| 1．2 植物病毒运动蛋白介导的抗病性 | 第71-72页 |
| 1．3 植物病毒运动蛋白与转录后基因沉默 | 第72-74页 |
| 2 材料与方法 | 第74-80页 |
| 2．1 材料 | 第74页 |
| 2．1．1 毒源 | 第74页 |
| 2．1．2 菌株质粒 | 第74页 |
| 2．1．3 酶 | 第74页 |
| 2．1．4 缓冲液及培养基 | 第74页 |
| 2．1．5 化学试剂分子生物学试剂 | 第74页 |
| 2．2 方法 | 第74-80页 |
| 2．2．1 病毒的提纯及病毒RNA的提取 | 第74-75页 |
| 2．2．1．1 病毒的提纯 | 第74-75页 |
| 2．2．1．2 病毒RNA的提取 | 第75页 |
| 2．2．2 cDNA的合成及PCR扩增 | 第75-77页 |
| 2．2．2．1 合成引物 | 第75页 |
| 2．2．2．2 反转录 | 第75-76页 |
| 2．2．2．3 PCR扩增 | 第76页 |
| 2．2．2．4 RCR产物的纯化 | 第76-77页 |
| 2．2．3 PVX25KD蛋白基因的克隆 | 第77-78页 |
| 2．2．3．1 感受态细胞的制备 | 第77页 |
| 2．2．3．2 质粒DNA和扩增的目的片段的酶切 | 第77页 |
| 2．2．3．3 质粒DNA与目的片段DNA的连接 | 第77页 |
| 2．2．3．4 质粒DNA向大肠杆菌中转化 | 第77-78页 |
| 2．2．3．5 转化菌落PCR鉴定 | 第78页 |
| 2．2．3．6 质粒提取 | 第78页 |
| 2．2．3．7 重组质粒的酶切鉴定及PCR鉴定 | 第78页 |
| 2．2．3．8 基因序列的测定 | 第78页 |
| 2．2．4 植物表达载体的构建 | 第78-80页 |
| 2．2．4．1 植物表达载体的构建策略 | 第78页 |
| 2．2．4．2 目的片段与植物表达载体的连接 | 第78-79页 |
| 2．2．4．3 重组质粒pPVX25KDM向大肠杆菌转化 | 第79页 |
| 2．2．4．4 重组质粒pPVX25KDM向农杆菌转化 | 第79页 |
| 2．2．4．5 转化菌落PCR鉴定 | 第79页 |
| 2．2．4．6 转化菌落酶切鉴定 | 第79-80页 |
| 3 结果与分析 | 第80-90页 |
| 3．1 病毒RNA的提取 | 第80页 |
| 3．2 RT-PCR扩增PVX25KD运动蛋白基因 | 第80页 |
| 3．3 外源DNA与质粒载体的连接及重组质粒向大肠杆菌中的转化 | 第80-81页 |
| 3．4 重组质粒的酶切鉴定 | 第81-82页 |
| 3．5 cDNA的序列测定 | 第82-87页 |
| 3．6 植物表达载体的构建 | 第87-90页 |
| 3．6．1 植物表达载体的构建策略 | 第87-89页 |
| 3．6．2 目的片段与植物表达载体的连接 | 第89-90页 |
| 3．6．2．1 转化菌落PCR检测 | 第89页 |
| 3．6．2．2 转化菌落酶切检测 | 第89页 |
| 3．6．2．3 重组质粒向农杆菌中转化 | 第89-90页 |
| 4 讨论与结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-105页 |
| 附录Ⅰ常用缓冲液及培养基的配制 | 第105-110页 |
| 附录Ⅱ常用化学试剂分子生物学试剂及仪器 | 第110-111页 |
| 附录Ⅲ质粒图谱 | 第111-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第115页 |
