| 中文摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 缩略词 | 第17-18页 |
| 第一章 金鱼生长激素Ⅰ(gfGH Ⅰ)在大肠杆菌和水稻中的表达 | 第18-74页 |
| 1前言 | 第18-32页 |
| ·鱼生长激素的结构和功能 | 第18-23页 |
| ·鱼生长激素的分离 | 第18页 |
| ·鱼生长激素的结构 | 第18-20页 |
| ·鱼生长激素的功能 | 第20-23页 |
| ·鱼类生长激素异源表达研究 | 第23-29页 |
| ·大肠杆菌表达体系 | 第24-25页 |
| ·蓝藻表达体系 | 第25-26页 |
| ·酵母表达系统 | 第26-28页 |
| ·植物反应器表达体系 | 第28-29页 |
| ·外源生长激素进入鱼体的途径和方法 | 第29-30页 |
| ·GH引入鱼体的途径 | 第29-30页 |
| ·GH保护剂的研制 | 第30页 |
| ·本实验研究目的和意义 | 第30-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-52页 |
| ·材料、菌株、质粒 | 第32页 |
| ·植物材料 | 第32页 |
| ·菌株 | 第32页 |
| ·质粒 | 第32页 |
| ·主要化学试剂及仪器 | 第32-36页 |
| ·主要化学试剂 | 第32-33页 |
| ·主要仪器 | 第33页 |
| ·质粒抽提相关溶液 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液 | 第33-34页 |
| ·Western blotting相关溶液 | 第34-35页 |
| ·ELISA所用试剂 | 第35页 |
| ·其它相关溶液 | 第35页 |
| ·培养基的配制 | 第35-36页 |
| ·引物设计和序列分析 | 第36页 |
| ·gfGH Ⅰ基因测序和序列分析 | 第36页 |
| ·gfGH Ⅰ基因的原核表达,纯化 | 第36-44页 |
| ·原核表达载体pET28a-gfGH Ⅰ和pGEX-4T-2-gfGH Ⅰ的构建 | 第36-40页 |
| ·诱导表达及蛋白存在形式 | 第40页 |
| ·目的蛋白(His)_6tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析 | 第40页 |
| ·目的蛋白(His)_6tag-gfGH Ⅰ的Western blotting检测 | 第40-42页 |
| ·连续超声破碎法回收目的蛋白(His)_6tag-gfGH Ⅰ | 第42页 |
| ·多克隆抗血清的制备 | 第42页 |
| ·间接ELISA法检测多克隆血清效价 | 第42-43页 |
| ·GST Resin纯化介质回收表达的目的蛋白GSTtag-gfGH Ⅰ | 第43-44页 |
| ·Bradford法测定蛋白质含量 | 第44页 |
| ·GSTtag-gfGH Ⅰ促进锦鲤生长实验 | 第44页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第44-48页 |
| ·中间表达载体的构建和鉴定 | 第44-46页 |
| ·gfGH Ⅰ植物表达载体的构建及鉴定 | 第46-48页 |
| ·农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第48-49页 |
| ·农杆菌感受态的制备与转化 | 第48页 |
| ·水稻材料(中花11)的预处理 | 第48页 |
| ·农杆菌侵染液的制备 | 第48页 |
| ·转化感染 | 第48-49页 |
| ·预分化 | 第49页 |
| ·分化及再生培养 | 第49页 |
| ·转基因水稻检测 | 第49-52页 |
| ·组织化学染色法检测GUS基因表达 | 第49页 |
| ·PCR检测转基因植株 | 第49-50页 |
| ·RT-PCR检测检测转基因植株 | 第50-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-70页 |
| ·gfGH Ⅰ序列分析 | 第52-53页 |
| ·gfGH Ⅰ的原核表达,纯化,生物活性实验 | 第53-62页 |
| ·原核表达载体pET28a-gfGH Ⅰ和pGEX-4T-2-gfGH Ⅰ的构建 | 第53-55页 |
| ·诱导表达及蛋白存在形式 | 第55-57页 |
| ·目的蛋白(His)_6tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析 | 第57-58页 |
| ·目的蛋白(His)_6tag-gfGH Ⅰ的Western blotting特异性分析 | 第58-59页 |
| ·连续超声破碎法回收(His)_6tag-gfGH Ⅰ | 第59页 |
| ·间接ELISA检测抗血清效价 | 第59页 |
| ·GST Resin纯化介质回收GSTtag-gfGH Ⅰ | 第59-60页 |
| ·GSTtag-gfGH Ⅰ的生物活性鉴定 | 第60-62页 |
| ·gfGH Ⅰ植物表达载体构建和鉴定 | 第62-64页 |
| ·中间载体pBPF-gfGH Ⅰ构建和鉴定 | 第62-63页 |
| ·植物表达载体p1301-35S-gfGH Ⅰ的构建以及鉴定 | 第63-64页 |
| ·水稻愈伤组织的遗传转化 | 第64-65页 |
| ·转基因水稻检测 | 第65-67页 |
| ·组织化学染色检测 | 第65-66页 |
| ·转基因植株的PCR检测 | 第66-67页 |
| ·RT-PCR法检测gfGH Ⅰ基因的转录水平 | 第67页 |
| ·转gfGH Ⅰ水稻T_1代植株的分子生物学检测结果 | 第67-70页 |
| ·转基因水稻T_1代植株获得 | 第67-68页 |
| ·转基因水稻T_1代株系PCR检测结果 | 第68-69页 |
| ·转基因水稻T_1代株系的RT-PCR检测 | 第69-70页 |
| 4 讨论 | 第70-74页 |
| ·gfGH Ⅰ基因的原核表达 | 第70-71页 |
| ·提高原核表达蛋白的可溶性 | 第71页 |
| ·多克隆抗血清的制备 | 第71-72页 |
| ·促进锦鲤生长的生物活性实验 | 第72页 |
| ·水稻愈伤组织的诱导及转化 | 第72-73页 |
| ·转基因植物的基因沉默 | 第73-74页 |
| 第二章 人类角质细胞生长因子(KGF)在毕赤酵母中的表达 | 第74-104页 |
| 1 前言 | 第74-85页 |
| ·角质细胞生长因子概述 | 第74-77页 |
| ·角质细胞生长因子及其分子结构 | 第74页 |
| ·KGF的生物学作用 | 第74-77页 |
| ·重组角质细胞生长因子的研究现状 | 第77页 |
| ·巴斯德毕氏酵母概述 | 第77-85页 |
| ·P.pastoris的生物学与遗传学特性 | 第77-78页 |
| ·P.pastoris表达外源蛋白的优势 | 第78-79页 |
| ·表达载体 | 第79-80页 |
| ·表达宿主菌 | 第80-81页 |
| ·外源基因与宿主染色体的整合 | 第81-83页 |
| ·外源基因在毕氏酵母中的表达 | 第83-84页 |
| ·重组蛋白的翻译后修饰 | 第84-85页 |
| 2 材料与方法 | 第85-92页 |
| ·材料 | 第85页 |
| ·菌株 | 第85页 |
| ·质粒 | 第85页 |
| ·主要试剂及溶液的配制 | 第85-86页 |
| ·酵母培养基储备液 | 第85-86页 |
| ·酵母总DNA的抽提溶液 | 第86页 |
| ·融合KGF基因毕氏酵母表达载体的构建 | 第86-87页 |
| ·GS115感受态细胞的制作与转化 | 第87-88页 |
| ·GS115感受态的制备 | 第87页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-KGF线性化 | 第87页 |
| ·表达载体pPIC9K-KGF转化GS115感受态细胞 | 第87-88页 |
| ·转化子的PCR快速鉴定 | 第88页 |
| ·重组转化子表型的筛选 | 第88页 |
| ·酵母整合的PCR分析 | 第88-89页 |
| ·酵母基因组总DNA的提取 | 第88-89页 |
| ·PCR扩增 | 第89页 |
| ·目的基因在酵母中的表达 | 第89-92页 |
| ·酵母的甲醇诱导 | 第89-90页 |
| ·RT-PCR检测诱导表达后的转基因酵母 | 第90-91页 |
| ·蛋白质的提取 | 第91页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第91-92页 |
| ·酵母表达时间的优化 | 第92页 |
| 3 结果与分析 | 第92-100页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第92-94页 |
| ·转化GS115阳性克隆的PCR鉴定 | 第94-95页 |
| ·重组转化子表型的筛选 | 第95-96页 |
| ·PCR分析外源基因在酵母中的整合 | 第96-97页 |
| ·RT-PCR检测甲醇诱导的转基因酵母 | 第97页 |
| ·外源基因的诱导表达 | 第97-98页 |
| ·外源基因的诱导表达的最佳时间 | 第98-100页 |
| 4 讨论 | 第100-104页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第100页 |
| ·转化子的筛选 | 第100-101页 |
| ·基因剂量对外源蛋白的影响 | 第101页 |
| ·影响外源蛋白高效表达的外源因素 | 第101-104页 |
| 结论和展望 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
