| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 文献综述 | 第16-39页 |
| 引言 | 第16页 |
| 1 辣椒疫病的研究进展 | 第16-20页 |
| ·辣椒疫病的危害 | 第16-17页 |
| ·传播途径及发病规律 | 第17页 |
| ·生理生化形状 | 第17-18页 |
| ·辣椒疫霉病害防治 | 第18-20页 |
| 2 植物真菌致病基因的研究进展 | 第20-24页 |
| ·与侵染结构产生有关的基因 | 第20-21页 |
| ·与细胞壁降解有关的基因 | 第21页 |
| ·与寄主反应代谢物有关的基因 | 第21-22页 |
| ·毒素基因 | 第22-23页 |
| ·与信号传导有关的基因 | 第23-24页 |
| 3 果胶甲基酯酶研究进展 | 第24-27页 |
| ·果胶 | 第24-25页 |
| ·果胶酶 | 第25-27页 |
| ·果胶酶的分布 | 第25-26页 |
| ·果胶酶类型上的分化 | 第26-27页 |
| 4 果胶酶的应用性研究 | 第27-28页 |
| ·利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁 | 第27页 |
| ·部分分解细胞间质中的果胶物质 | 第27-28页 |
| ·利用果胶酶生产果胶低聚糖 | 第28页 |
| 5 果胶甲基酯酶 | 第28-34页 |
| ·果胶甲基酯酶的存在与来源 | 第28-29页 |
| ·果胶甲基酯酶的分子量及分子组成 | 第29页 |
| ·果胶甲基酯酶的结构 | 第29-31页 |
| ·果胶甲基酯酶的性质与作用机理 | 第31-32页 |
| ·果胶甲基酯酶分子生物学研究 | 第32-34页 |
| 6 利用酵母体系表达外源蛋白的研究进展 | 第34-38页 |
| ·毕赤酵母表达体系 | 第34-35页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的生物学特性 | 第35-36页 |
| ·毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型 | 第36-37页 |
| ·表达载体在毕赤酵母中的整合 | 第37-38页 |
| 7 实验目的及意义 | 第38-39页 |
| 第一章 果胶甲基酯酶基因克隆与测序 | 第39-54页 |
| 1 材料与方法 | 第39-44页 |
| ·材料 | 第39-41页 |
| ·DNA 文库 | 第39页 |
| ·菌株与质粒 | 第39页 |
| ·酶和生化试剂 | 第39页 |
| ·仪器 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·溶液配制 | 第40-41页 |
| ·实验方法 | 第41-44页 |
| ·引物设计 | 第41页 |
| ·96 个克隆总质粒DNA 的大量提取（碱裂解法） | 第41-42页 |
| ·16 个克隆总质粒DNA 的提取 | 第42页 |
| ·单个克隆质粒 DNA 的提取 | 第42-43页 |
| ·Pool PCR 法筛选基因组文库 | 第43页 |
| ·基因序列的生物信息学分析 | 第43-44页 |
| 2 结果与分析 | 第44-51页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme6基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第45-46页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因pcpm7 的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第46-48页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme8基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第48-49页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶pcpme9基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第49-51页 |
| 3 讨论 | 第51-54页 |
| ·PCR 常见问题及解决方案 | 第51页 |
| ·利用基因组文库筛选基因 | 第51-52页 |
| ·果胶甲基酯酶基因的结构分析 | 第52-54页 |
| 第二章 Race 分离果胶甲基酯酶基因 pcpme9 3’端 | 第54-64页 |
| 1 材料与方法 | 第54-58页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·菌株与质粒 | 第54页 |
| ·酶和生化试剂 | 第54页 |
| ·仪器 | 第54页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-58页 |
| ·辣椒疫霉菌RNA 的提取 | 第55页 |
| ·cDNA 的合成 | 第55-56页 |
| ·引物设计 | 第56页 |
| ·用 RACE cDNA Amplification Kit 扩增目的片段 | 第56-57页 |
| ·目的片段连接转化 | 第57-58页 |
| ·克隆测序 | 第58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-61页 |
| ·RNA 的提取 | 第58-59页 |
| ·RACE PCR 结果 | 第59-60页 |
| ·测序结果 | 第60-61页 |
| 3 讨论 | 第61-64页 |
| ·总 RNA 的提取 | 第61-62页 |
| ·RACE 技术 | 第62-64页 |
| 第三章 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶 pcpme6 的真核表达和 western blot | 第64-95页 |
| 1 材料和方法 | 第64-79页 |
| ·材料 | 第64-67页 |
| ·菌株和质粒 | 第64页 |
| ·酶和生化试剂 | 第64-65页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第65-67页 |
| ·主要仪器设备 | 第67页 |
| ·实验方法 | 第67-79页 |
| ·果胶甲基酯酶基因pcpme6 成熟肽基因序列的分离 | 第67-68页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第68-71页 |
| ·重组转化子鉴定与筛选 | 第71-75页 |
| ·果胶甲基酯酶 Pcpme6 基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第75页 |
| ·果胶甲基酯酶SDS-PAGE 分析 | 第75-77页 |
| ·利用基因表达产物制备兔抗血清 | 第77-78页 |
| ·Western blot 杂交 | 第78-79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-86页 |
| ·pcpme6 成熟肽基因序列的分离 | 第79-80页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第80-82页 |
| ·酵母转化子筛选与鉴定 | 第82-84页 |
| ·重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE 分析 | 第84-85页 |
| ·western blot 杂交 | 第85-86页 |
| 3 讨论 | 第86-95页 |
| ·表达系统的选择 | 第86-87页 |
| ·外源基因在 Pichia pastoris 中的分泌表达的必要性 | 第87-88页 |
| ·影响外源基因表达量的因素 | 第88-92页 |
| ·表达载体的构建策略 | 第88-89页 |
| ·电转化提高转化效率 | 第89页 |
| ·表达载体与宿主染色体的整合 | 第89-90页 |
| ·外源基因的拷贝数 | 第90-91页 |
| ·产物的稳定性 | 第91页 |
| ·培养条件 | 第91-92页 |
| ·表达果胶甲基酯酶PME6 的活性 | 第92页 |
| ·western blot | 第92-95页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第92-93页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第93页 |
| ·转膜 | 第93-95页 |
| 结论与建议 | 第95-97页 |
| 1 结论 | 第95页 |
| 2 建议 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第111页 |
