ChIFN-γ基因的植物表达及其生物活性研究
| 缩略词表 | 第1-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| Summary | 第14-18页 |
| 第一章 前言 | 第18-39页 |
| 1.细胞因子的概念 | 第18页 |
| 2.干扰素的作用机制 | 第18-24页 |
| ·IFN的分类及产生细胞 | 第20页 |
| ·IFN-γ信号传导通路 | 第20-21页 |
| ·IFN-γ的生物学作用 | 第21-24页 |
| ·抗病毒作用 | 第21-22页 |
| ·免疫调节作用 | 第22页 |
| ·抗肿瘤作用 | 第22-23页 |
| ·控制细胞凋亡 | 第23页 |
| ·增强疫苗免疫 | 第23-24页 |
| ·抗虫作用 | 第24页 |
| 3.IFN-γ基因的研究 | 第24-28页 |
| ·IFN-γ基因 | 第24-25页 |
| ·IFN-γ基因的克隆与表达 | 第25-28页 |
| 4.植物转基因的基本方法 | 第28-30页 |
| ·根癌农杆菌介导转化法 | 第28页 |
| ·激光微束穿刺转化法 | 第28-29页 |
| ·子房注射法 | 第29页 |
| ·基因枪法 | 第29-30页 |
| 5.转基因植物生物反应器存在的问题及解决途径 | 第30-35页 |
| ·转基因植物表达活性蛋白质 | 第30-31页 |
| ·转基因植物生物反应器存在的问题 | 第31-32页 |
| ·转基因植物生物反应器问题的主要解决途径 | 第32-35页 |
| ·提高转基因植物外源蛋白表达量 | 第32页 |
| ·外源基因序列的优化 | 第32页 |
| ·改变或附加调控元件 | 第32-33页 |
| ·选择特异性启动子或诱导型启动子 | 第33页 |
| ·选用内含子增强基因表达 | 第33页 |
| ·重组蛋白的亚细胞定位 | 第33-34页 |
| ·叶绿体转化 | 第34页 |
| ·利用融合系统表达重组蛋白 | 第34页 |
| ·转基因植物表达外源蛋白的N-糖基化修饰改造 | 第34-35页 |
| 6.本论文研究的目的及意义 | 第35-39页 |
| 第二章 ChIFN-γ基因的合成及载体构建 | 第39-62页 |
| 1.材料与方法 | 第39-46页 |
| ·材料 | 第39-41页 |
| ·菌株及质粒 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·植物材料 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·PCR引物 | 第40-41页 |
| ·方法 | 第41-46页 |
| ·PCR反应体系 | 第41页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第42-43页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第43页 |
| ·质粒DNA的提取与纯化 | 第43-44页 |
| ·植物基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| ·DNA的酶切 | 第45页 |
| ·DNA的连接 | 第45页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 | 第45-46页 |
| ·DNA测序 | 第46页 |
| 2.结果与分析 | 第46-59页 |
| ·ChIFN-γ基因的设计与合成 | 第46-47页 |
| ·pSH-NGN载体的构建 | 第47-59页 |
| ·Napin启动子的克隆 | 第47页 |
| ·NOS终止子的克隆 | 第47-48页 |
| ·pSH-NGN载体的构建 | 第48-57页 |
| ·pSH-NGNL载体的构建 | 第57-58页 |
| ·pSH-IFNG载体的构建 | 第58-59页 |
| 3.讨论 | 第59-62页 |
| 第三章 ChIFN-γ基因的瞬时表达与遗传转化 | 第62-96页 |
| 1.材料与方法 | 第62-77页 |
| ·材料 | 第62-69页 |
| ·植物材料 | 第62-63页 |
| ·质粒与菌株 | 第63页 |
| ·培养基 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63-69页 |
| ·质粒大量提取试剂: | 第63-64页 |
| ·组培相关试剂 | 第64-65页 |
| ·GUS染色试剂 | 第65页 |
| ·蛋白相关试剂 | 第65-68页 |
| ·RNA相关试剂 | 第68-69页 |
| ·其它试剂 | 第69页 |
| ·主要仪器 | 第69页 |
| ·方法 | 第69-77页 |
| ·瞬时表达 | 第70页 |
| ·植物总蛋白质提取 | 第70-71页 |
| ·GUS活性检测 | 第71页 |
| ·ELSIA检测样品中ChIFN-γ蛋白含量 | 第71-72页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第72页 |
| ·表达产物的western blotting分析 | 第72-73页 |
| ·Trizol法提取植物总RNA | 第73-74页 |
| ·RNA甲醛变性凝胶电泳 | 第74页 |
| ·RT-PCR | 第74-75页 |
| ·烟草遗传转化 | 第75-76页 |
| ·油菜遗传转化 | 第76-77页 |
| ·田间转基因植物生长性状观察 | 第77页 |
| 2.结果与分析 | 第77-92页 |
| ·ChIFN-γ在生菜中的瞬时表达 | 第77-82页 |
| ·不同瞬时表达条件对ChIFN-γ斗表达量的影响 | 第77-78页 |
| ·GUS染色 | 第78-79页 |
| ·不同载体表达ChIFN-γ蛋白的差异 | 第79-81页 |
| ·不同提取方法对ChIFN-γ蛋白提取效率的影响 | 第81页 |
| ·Western blot检测ChIFN-γ蛋白 | 第81-82页 |
| ·ChIFN-γ基因遗传转化烟草及检测 | 第82-88页 |
| ·ChIFN-γ基因遗传转化烟草 | 第82-83页 |
| ·转ChIFN-γ基因烟草的检测 | 第83-87页 |
| ·转基因烟草植株性状观察 | 第87-88页 |
| ·ChIFN-γ基因遗传转化油菜及检测 | 第88-92页 |
| ·ChIFN-γ基因遗传转化油菜 | 第88-90页 |
| ·转ChIFN-γ基因油菜的检测 | 第90-92页 |
| 3.讨论 | 第92-96页 |
| 第四章 转基因植物ChIFN-γ蛋白的活性检测 | 第96-117页 |
| 1.材料与方法 | 第96-103页 |
| ·材料 | 第96-99页 |
| ·鸡胚与病毒 | 第96-97页 |
| ·细胞培养液 | 第97-98页 |
| ·供试昆虫 | 第98页 |
| ·TMV稀释缓冲液(PBS) | 第98-99页 |
| ·方法 | 第99-103页 |
| ·鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 | 第99页 |
| ·样品制备 | 第99页 |
| ·病毒的增殖 | 第99-100页 |
| ·细胞计数 | 第100页 |
| ·病毒血凝价的测定 | 第100页 |
| ·VSV病毒TCID_(50)测定 | 第100页 |
| ·ChIFN-γ抗病毒活性检测 | 第100页 |
| ·TMV病毒液的制备与攻毒 | 第100-101页 |
| ·TMV病毒液的制备与检测 | 第100-101页 |
| ·TMV接种浓度的选择 | 第101页 |
| ·烟草对TMV的抗性测定 | 第101页 |
| ·抗虫试验 | 第101-102页 |
| ·抗蚜虫试验 | 第101页 |
| ·抗斜纹夜蛾幼虫试验 | 第101-102页 |
| ·动物喂养实验 | 第102-103页 |
| ·转基因烟草的漂浮育苗 | 第102页 |
| ·含ChIFN-γ饲料的制备 | 第102页 |
| ·动物喂养及攻毒 | 第102-103页 |
| ·凝集试验 | 第103页 |
| ·感染NDV雏鸡的表观症状及病理观察 | 第103页 |
| ·雏鸡体重测定 | 第103页 |
| 2.结果与分析 | 第103-114页 |
| ·ChIFN-γ抗VSV病毒活性 | 第103-107页 |
| ·VSV增殖 | 第103-104页 |
| ·病毒TCID_(50)测定 | 第104-105页 |
| ·ChIFN-γ抗病毒活性 | 第105-107页 |
| ·转ChIFN-γ烟草植株抗TMV病毒试验 | 第107-109页 |
| ·转基因烟草抗蚜性 | 第109页 |
| ·转ChIFN-γ烟草抗斜纹夜蛾幼虫试验 | 第109-111页 |
| ·动物喂养实验 | 第111-114页 |
| ·转ChIFN-γ烟草T_1代漂浮育苗 | 第111页 |
| ·NDV病毒血凝价的测定 | 第111-112页 |
| ·动物喂养试验 | 第112-114页 |
| 3.讨论 | 第114-117页 |
| 第五章 转ChIFN-γ基因烟草的抗虫机制 | 第117-135页 |
| 1.材料与方法 | 第117-121页 |
| ·材料 | 第117页 |
| ·植物材料 | 第117页 |
| ·烟青虫 | 第117页 |
| ·方法 | 第117-121页 |
| ·烟碱含量测定 | 第117-118页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第118-119页 |
| ·烟青虫体外饲喂试验 | 第118页 |
| ·酪氨酸标准曲线的制作 | 第118页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第118-119页 |
| ·组织切片 | 第119-121页 |
| ·GC-MS测定烟草中挥发性成分 | 第121页 |
| ·腺毛密度的测定 | 第121页 |
| 2.结果与分析 | 第121-132页 |
| ·烟碱含量的测定 | 第121-122页 |
| ·烟青虫蛋白酶活力测定 | 第122-123页 |
| ·植物组织形态观察 | 第123-125页 |
| ·烟草中挥发性成分测定 | 第125-131页 |
| ·烟草腺毛的密度 | 第131-132页 |
| 3.讨论 | 第132-135页 |
| 结论与展望 | 第135-138页 |
| 1.研究结论 | 第135页 |
| 2.研究创新 | 第135-136页 |
| 3.工作展望 | 第136页 |
| 4.存在的不足 | 第136-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 参考文献 | 第139-156页 |
| 附录 | 第156-157页 |
