| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-13页 |
| 前言 | 第13-31页 |
| 一、MICRORNA是基因表达调控网络中参与基因转录后水平调节的新成员 | 第13-25页 |
| (一) miRNAs基因的发现与克隆 | 第13-14页 |
| (二) miRNAs的生物合成 | 第14-19页 |
| 1.miRNA基因的转录与转录初产物的剪接 | 第15-17页 |
| 2.miRNA前体的转运出核 | 第17-18页 |
| 3.pre-miRNA的剪切与miRNA的成熟 | 第18-19页 |
| (三) miRNAs基因的时空表达与调控 | 第19-20页 |
| (四) microRNA对靶基因的识别以及作用机制 | 第20-21页 |
| (五) miRNA的功能 | 第21-25页 |
| 1.miRNA在几种动植物模式生物中的功能 | 第21-24页 |
| ·miRNA在拟南芥(Arabidopsis thaliaha)中的功能 | 第21-22页 |
| ·miRNA在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的功能 | 第22-23页 |
| ·miRNA在果蝇(Drosophila melanogaster)中的功能 | 第23页 |
| ·miRNA在斑马鱼(zebrafish)中的功能 | 第23-24页 |
| ·miRNA在小鼠(mouse)中的功能 | 第24页 |
| 2.miRNA与人类(human)疾病 | 第24-25页 |
| 二、HNF4与MIR-122肝脏特异性表达的潜在联系 | 第25-29页 |
| (一) HNF4是肝脏中高表达的调节脂类代谢相关基因的重要转录因子 | 第25-28页 |
| (二) miR-122是一个肝脏特异性高表达并参与脂类代谢的microRNA | 第28-29页 |
| 三、本文主要研究内容 | 第29-31页 |
| 材料与方法 | 第31-63页 |
| 一、材料 | 第31-37页 |
| 1.菌株和质粒 | 第31页 |
| 2.细胞系 | 第31页 |
| 3.限制性内切酶及其它修饰酶类 | 第31-32页 |
| 4.各种转染试剂 | 第32页 |
| 5.抗体 | 第32页 |
| 6.其它主要试剂及试剂盒 | 第32页 |
| 7.主要仪器 | 第32-33页 |
| 8.放射性核素 | 第33页 |
| 9.生物信息学软件和数据库 | 第33页 |
| 10.实验中所用寡聚核苷酸列表 | 第33-37页 |
| ·引物 | 第34-36页 |
| ·探针 | 第36页 |
| ·本研究中所用的合成siRNA的DNA序列 | 第36-37页 |
| 二、实验方法 | 第37-63页 |
| 1.质粒的构建 | 第39-42页 |
| 1) 酶切反应 | 第39页 |
| 2) DNA片段回收 | 第39页 |
| 3) DNA片段3’凹端的补平 | 第39页 |
| 4) DNA片段3’凸端的削平 | 第39-40页 |
| 5) 载体的脱磷酸化 | 第40页 |
| 6) 连接反应 | 第40-41页 |
| 7) 感受态大肠杆菌细胞制备 | 第41页 |
| 8) 转化 | 第41页 |
| 9) 质粒DNA的小量制备 | 第41-42页 |
| 10) 质粒DNA的大量制备 | 第42页 |
| 2.细胞培养 | 第42-43页 |
| 1) G418溶液配制 | 第42-43页 |
| 2) 细胞生长条件 | 第43页 |
| 3) 细胞传代 | 第43页 |
| 4) 复苏及冻存 | 第43页 |
| 3.脂质体转染质粒DNA | 第43-44页 |
| 4.病毒包装与转导 | 第44-45页 |
| 1) 病毒包装、病毒上清收集及冻存 | 第44-45页 |
| 2) 病毒转导靶细胞的程序 | 第45页 |
| 5.miRNA前体结构分析 | 第45-51页 |
| 1) Northern blot分析 | 第45-47页 |
| a) 从转染细胞中提取总RNA | 第45页 |
| b) 电泳 | 第45-46页 |
| c) Northern转膜 | 第46页 |
| d) 预杂交 | 第46页 |
| e) DNA探针标记 | 第46页 |
| f) 杂交 | 第46-47页 |
| g) 洗膜及放射自显影 | 第47页 |
| 2) miRNA前体的RT-PCR分析 | 第47页 |
| a) 从转染细胞中提取总RNA | 第47页 |
| b) 反转录成cDNA第一链(参照产品说明) | 第47页 |
| c) 利用前体特异性引物进行PCR检测 | 第47页 |
| d) 数据分析 | 第47页 |
| 3) 5’RNA末端快速扩增(5'RACE) | 第47-51页 |
| a) 设计并合成5’磷酸化修饰的特异性引物 | 第48页 |
| b) Huh7细胞总RNA的提取 | 第48页 |
| c) 反转录成cDNA第一链(参照产品说明) | 第48-49页 |
| d) 利用RNaseH降解RNA | 第49页 |
| e) cDNA第一链的自环化连接 | 第49页 |
| f) 第一次PCR反应 | 第49-50页 |
| g) 第二次PCR反应 | 第50-51页 |
| h) 电泳、回收 | 第51页 |
| i) 克隆、测序和比对 | 第51页 |
| 6.miRNA表达分析 | 第51-53页 |
| 1) miRNA前体的定量PCR分析 | 第51页 |
| a) 从转染细胞中提取总RNA | 第51页 |
| b) 反转录成cDNA第一链(参照产品说明) | 第51页 |
| c) 定量PCR分析 | 第51页 |
| d) 数据分析 | 第51页 |
| 2) miRNA表达的Northern blot分析 | 第51-53页 |
| a) 从转染细胞中提取总RNA | 第51-52页 |
| b) 变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第52页 |
| c) 样品处理、上样、电泳 | 第52页 |
| d) 电转移 | 第52页 |
| e) 探针标记 | 第52-53页 |
| f) 杂交 | 第53页 |
| g) 放射性自显影和X光片冲洗 | 第53页 |
| 7.半定量RT-PCR检测基因的mRNA表达水平 | 第53-54页 |
| 1) 从细胞中提取细胞总RNA | 第53页 |
| 2) 反转录成cDNA第一链(参照产品说明) | 第53页 |
| 3) 半定量RT-PCR | 第53-54页 |
| 8.双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第54-55页 |
| 9.染色质免疫共沉淀(CHIP) | 第55-57页 |
| A部分 DNA剪切(1x106细胞) | 第55页 |
| B部分 免疫共沉淀 | 第55-56页 |
| C部分 洗脱结合于转录因子的DNA | 第56页 |
| D部分 苯/氯仿法提取DNA | 第56-57页 |
| E部分 PCR | 第57页 |
| 10.电泳迁移率变动实验(EMSA) | 第57-60页 |
| ·溶液配制 | 第57-58页 |
| ·核蛋白提取 | 第58页 |
| ·放射性标记探针 | 第58-59页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第59页 |
| ·显影 | 第59-60页 |
| 11.Western Blot | 第60-63页 |
| ·细胞及组织总蛋白提取 | 第60页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第60页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第60-61页 |
| ·抗原抗体反应 | 第61页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第61-62页 |
| ·溶液配制 | 第62-63页 |
| 实验结果 | 第63-84页 |
| 一、MIR-22在进化上具有高度保守性 | 第63-64页 |
| 二、MIR-122前体位于一个肝脏特异性高表达的连续的转录单元内 | 第64-67页 |
| 三、MIR-122成熟序列是由一个较大的具有内含子的前体转录本中剪切得到的 | 第67-70页 |
| 四、MIR-122前体是由其5’上游的一个进化上保守的启动子区域指导转录的 | 第70-75页 |
| 五、HNF4对MIR-122启动子区具有明显的上调作用 | 第75-78页 |
| 六、通过上调和下调HNF4的表达,证明HNF4对MIR-122表达具有明显的正调节作用 | 第78-79页 |
| 七、MIR-122负调节定位于线粒体的多种基因 | 第79-81页 |
| 八、不同刺激条件下,MIR-122表达呈现动态变化与平衡 | 第81-84页 |
| 讨论 | 第84-94页 |
| 一、MICRORNA各种检测方法的优缺点 | 第84-87页 |
| 1.Norther blot | 第84页 |
| 2.结合生物信息学的验证方法 | 第84页 |
| 3.miRNA前体检测法 | 第84-85页 |
| 4.液相杂交法 | 第85页 |
| 5.Taqman探针定量PCR法 | 第85-86页 |
| 6.寡聚核苷酸的微排列芯片 | 第86-87页 |
| 7.Solexa测序法 | 第87页 |
| 二、MIR-122前体的转录可能受到多种转录因子的调节 | 第87-89页 |
| 三、MIR-122在代谢过程的变化以及对代谢平衡的作用 | 第89-91页 |
| 四、MIR-122与线粒体合成和能量代谢具有内在联系 | 第91-92页 |
| 五、本课题研究的不足与完善的方案 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-101页 |
| 小结 | 第101-102页 |
| 非论文综述 | 第102-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 个人简历 | 第111-113页 |
