| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 引言 | 第10-12页 |
| 第一部分 AKT SHRNA的设计合成及其入门载体的构建 | 第12-24页 |
| 1 材料 | 第12-14页 |
| ·主要试剂与溶液配制 | 第12-13页 |
| ·耗材与主要仪器设备 | 第13-14页 |
| 2 方法 | 第14-19页 |
| ·Akt1/2特异性干扰序列的设计合成 | 第14-15页 |
| ·双链寡核苷酸(ds oligo)的合成 | 第15页 |
| ·连接反应 | 第15-16页 |
| ·转化和阳性克隆筛选 | 第16页 |
| ·菌落PCR | 第16-18页 |
| ·质粒小量提取 | 第18-19页 |
| 3 结果 | 第19-22页 |
| ·双链寡核苷酸退火完整性检测的电泳结果 | 第19页 |
| ·U6入门载体阳性克隆的初步筛选与鉴定结果 | 第19-20页 |
| ·Akt基因片段特异性干扰序列克隆测序图 | 第20-21页 |
| ·重组质粒初步鉴定电泳图 | 第21-22页 |
| 4 讨论 | 第22-24页 |
| 第二部分 细胞培养和AKT SHRNA的U6入门载体干扰效果验证 | 第24-38页 |
| 1 材料 | 第24-27页 |
| ·细胞培养试剂 | 第24页 |
| ·主要试剂盒及溶液配制 | 第24-26页 |
| ·主要仪器设备和耗材 | 第26-27页 |
| ·肿瘤细胞株 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-32页 |
| ·细胞的培养 | 第27-28页 |
| ·质粒瞬时转染肿瘤细胞 | 第28页 |
| ·转染后肿瘤细胞RNA抽提(Trizol法) | 第28-29页 |
| ·RT-PCR检测Akt RNA表达水平 | 第29-30页 |
| ·Western blot检测Akt蛋白表达水平 | 第30-32页 |
| 3 结果 | 第32-36页 |
| ·镜下细胞形态 | 第32-33页 |
| ·转染前后细胞形态对比 | 第33-34页 |
| ·转染后RNA的提取 | 第34页 |
| ·RT-PCR检测Akt基因表达 | 第34-36页 |
| ·蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-38页 |
| 第三部分 AKT SHRNA的目的表达载体的构建及其干扰效果验证 | 第38-48页 |
| 1 材料 | 第38-41页 |
| ·主要试剂与溶液配制 | 第38-41页 |
| ·主要仪器设备与耗材 | 第41页 |
| 2 方法 | 第41-44页 |
| ·LR重组反应 | 第41-42页 |
| ·转化Stb13 E.coli大肠感受态细胞 | 第42页 |
| ·菌落PCR初筛 | 第42-43页 |
| ·重组质粒克隆抗性鉴定 | 第43-44页 |
| ·重组质粒克隆测序 | 第44页 |
| ·质粒小量提取 | 第44页 |
| ·转染细胞 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-47页 |
| ·目的表达载体阳性克隆的初步筛选和鉴定 | 第44页 |
| ·Akt干扰片段和阴性干扰片段序列测定 | 第44-45页 |
| ·重组质粒初步鉴定 | 第45-46页 |
| ·转染肿瘤细胞后RNA的抽提 | 第46页 |
| ·RT-PCR检测目的基因Akt表达水平 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 结语 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-52页 |
| 附录 | 第52-56页 |
| 研究生期间发表论文情况 | 第56-57页 |
| 致谢 | 第57页 |
