| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略语表 | 第9-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-18页 |
| 1.1 X射线晶体学研究 | 第15页 |
| 1.2 本论文的研究目的与内容 | 第15-16页 |
| 参考文献 | 第16-18页 |
| 第2章 X射线晶体学在结构生物学中的应用 | 第18-36页 |
| 2.1 蛋白质X射线晶体学简介 | 第18-23页 |
| 2.1.1 X射线晶体学简史 | 第18-20页 |
| 2.1.2 蛋白质晶体的获取方法 | 第20-22页 |
| 2.1.3 X射线衍射解析晶体结构的方法 | 第22-23页 |
| 2.2 从蛋白质晶体结构到催化机理 | 第23-29页 |
| 2.2.1 CALB的晶体学研究进展 | 第23-27页 |
| 2.2.2 BVMO晶体学研究进展 | 第27-29页 |
| 参考文献 | 第29-36页 |
| 第3章 CALB表达优化及S醇选择性突变体筛选 | 第36-53页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验部分 | 第36-43页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第36-37页 |
| 3.2.2 PCR引物 | 第37-38页 |
| 3.2.3 实验所需溶液配制 | 第38-40页 |
| 3.2.4 其他生化试剂 | 第40-41页 |
| 3.2.5 基因亚克隆 | 第41页 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化 | 第41-42页 |
| 3.2.7 CALB蛋白在大肠杆菌中表达 | 第42页 |
| 3.2.8 酵母感受态细胞制备及转化重组 | 第42页 |
| 3.2.9 CALB蛋白在酵母中表达 | 第42页 |
| 3.2.10 CALB蛋白纯化 | 第42-43页 |
| 3.2.11 CALB酶活及选择性测试 | 第43页 |
| 3.3 CALB在大肠杆菌中的胞内表达 | 第43-45页 |
| 3.3.1 pETM-11-calb在大肠杆菌中单独表达及纯化 | 第43-44页 |
| 3.3.2 pETM-11-calb与pGro7在大肠杆菌中共表达及纯化 | 第44-45页 |
| 3.4 CALB在大肠杆菌中的分泌表达 | 第45-47页 |
| 3.4.1 pET-22b-calb质粒构建 | 第45-46页 |
| 3.4.2 CALB在大肠杆菌中分泌表达及纯化 | 第46-47页 |
| 3.5 CALB在毕赤酵母中的分泌表达 | 第47-49页 |
| 3.5.1 穿梭质粒pPIC9K-calb的构建 | 第47页 |
| 3.5.2 pPIC9K-calb的转化重组 | 第47-48页 |
| 3.5.3 P-CALB甲醇诱导浓度筛选 | 第48页 |
| 3.5.4 CALB在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第48-49页 |
| 3.6 定向进化改变CALB手性选择性 | 第49-51页 |
| 3.6.1 三种CALB表达体系比较 | 第49页 |
| 3.6.2 CALB定向进化产生S醇选择性 | 第49-51页 |
| 3.7 小结 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-53页 |
| 第4章 | 第53-75页 |
| 4.2 | 第53-56页 |
| 4.2.3 实验所需溶液配制 | 第53-54页 |
| 4.2.4 CALB突变体蛋白在大肠杆菌中表达 | 第54-55页 |
| 4.2.5 CALB突变体蛋白纯化 | 第55页 |
| 4.2.6 蛋白母体结晶 | 第55页 |
| 4.2.7 蛋白与小分子的复合物结晶 | 第55-56页 |
| 4.2.8 蛋白晶体结构解析 | 第56页 |
| 4.3 CALB突变体蛋白纯化 | 第56页 |
| 4.4 CALB突变体蛋白晶体结构解析 | 第56-65页 |
| 4.4.1 MSR蛋白结构解析 | 第56-58页 |
| 4.4.2 MSS蛋白结构解析 | 第58-60页 |
| 4.4.3 MRS蛋白结构解析 | 第60-61页 |
| 4.4.4 MRR蛋白结构解析 | 第61-63页 |
| 4.4.5 四种突变体晶体结构分析 | 第63-65页 |
| 4.5 CALB突变体与产物的复合物晶体结构解析 | 第65-67页 |
| 4.5.1 2-苯基丙酸-1'-苯基乙酯与突变体蛋白的复合物结构解析 | 第65页 |
| 4.5.2 N-(2-苯基丙酰基)-1-苯基乙胺与突变体蛋白的复合物解析 | 第65-67页 |
| 4.6 MD模拟计算探究四种手性酯产物在对应突变体中的结合模式 | 第67-72页 |
| 4.6.1 探究四种突变体与不同构型底物结合力 | 第68-69页 |
| 4.6.2 探究四种不同选择性突变体的产物结合模式 | 第69-72页 |
| 4.7 小结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-75页 |
| 第5章 探究CALB突变体催化苯甲酸酯水解的催化机制 | 第75-94页 |
| 5.1 引言 | 第75-76页 |
| 5.2 实验部分 | 第76-80页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第76页 |
| 5.2.2 结晶初筛试剂 | 第76-77页 |
| 5.2.3 实验所需溶液配制 | 第77-78页 |
| 5.2.4 CALB突变体蛋白在大肠杆菌中表达 | 第78页 |
| 5.2.5 CALB突变体蛋白纯化 | 第78-79页 |
| 5.2.6 蛋白母体结晶 | 第79页 |
| 5.2.7 蛋白晶体结构解析 | 第79-80页 |
| 5.3 CALB突变体蛋白纯化 | 第80页 |
| 5.4 CALB突变体蛋白晶体结构解析 | 第80-88页 |
| 5.4.1 QW4蛋白结构解析 | 第80-84页 |
| 5.4.2 QW10蛋白结构解析 | 第84-86页 |
| 5.4.3 两种突变体蛋白晶体结构分析 | 第86-88页 |
| 5.5 计算化学方法探究苯甲酸对硝基苯酚酯水解的催化机制 | 第88-91页 |
| 5.5.1 MD模拟探究底物结合模式 | 第88-90页 |
| 5.5.2 QM/MM方法探究两类三联体的不同催化机制 | 第90-91页 |
| 5.6 小结 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-94页 |
| 第6章 CHMO蛋白的纯化与结晶 | 第94-113页 |
| 6.1 引言 | 第94-95页 |
| 6.2 实验部分 | 第95-100页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第95页 |
| 6.2.2 结晶初筛试剂 | 第95-96页 |
| 6.2.3 PCR引物 | 第96页 |
| 6.2.4 实验所需溶液配制 | 第96-98页 |
| 6.2.5 其他生化试剂 | 第98页 |
| 6.2.6 基因亚克隆 | 第98-99页 |
| 6.2.7 感受态细胞制备及质粒转化 | 第99页 |
| 6.2.8 CHMO蛋白在大肠杆菌中表达 | 第99页 |
| 6.2.9 CHMO突变体蛋白纯化 | 第99-100页 |
| 6.2.10 CHMO蛋白结晶 | 第100页 |
| 6.3 无标签的CHMO蛋白纯化 | 第100-103页 |
| 6.3.1 硫酸铵沉淀纯化CHMO | 第101-102页 |
| 6.3.2 阴离子交换树脂纯化CHMO | 第102页 |
| 6.3.3 凝胶层析纯化CHMO | 第102-103页 |
| 6.4 带有His-tag的CHMO纯化结晶 | 第103-104页 |
| 6.4.1 pSJ2-chmo质粒构建 | 第103页 |
| 6.4.2 带His-tag的CHMO纯化 | 第103-104页 |
| 6.5 CHMO的突变改造 | 第104-111页 |
| 6.5.1 CHMO序列截短的突变体结晶 | 第104-107页 |
| 6.5.2 CHMO表面墒突变体结晶 | 第107-108页 |
| 6.5.3 TrxA-CHMO融合蛋白结晶 | 第108-111页 |
| 6.6 小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-113页 |
| 第7章 总结与展望 | 第113-117页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第117页 |
