| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-27页 |
| 1.1 酿酒酵母概述 | 第10-11页 |
| 1.2 酿酒酵母蛋白质分泌途径及其质量控制系统基础研究 | 第11-16页 |
| 1.2.1 酿酒酵母蛋白质分泌途径概述 | 第11-13页 |
| 1.2.2 酿酒酵母蛋白质分泌途径质量控制系统研究 | 第13-16页 |
| 1.3 酿酒酵母β-葡萄糖苷酶表面展示表达 | 第16-22页 |
| 1.3.1 β-葡萄糖苷酶简介 | 第17页 |
| 1.3.2 表面展示技术简介 | 第17-20页 |
| 1.3.3 酿酒酵母表面展示表达 β-葡萄糖苷酶研究进展 | 第20-21页 |
| 1.3.4 酿酒酵母β-葡萄糖苷酶表面展示表达存在问题 | 第21-22页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9定向基因编辑技术及其在酿酒酵母中的应用 | 第22-25页 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9系统在细菌体内的免疫应答 | 第22-24页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9定向基因编辑技术靶向流程及应用 | 第24页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9定向基因编辑技术在酿酒酵母中的应用 | 第24-25页 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义、内容及技术路线 | 第25-27页 |
| 1.5.1 研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第26-27页 |
| 第2章 材料与方法 | 第27-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-37页 |
| 2.1.1 质粒、菌株与引物 | 第27-29页 |
| 2.1.2 主要使用的仪器设备 | 第29-31页 |
| 2.1.3 主要生化试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.4 重要溶液配制 | 第32-35页 |
| 2.1.5 培养基的配制 | 第35-37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-52页 |
| 2.2.1 不同微生物的培养与保藏 | 第37页 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备（化学转化法） | 第37-38页 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒转化实验 | 第38页 |
| 2.2.4 大肠杆菌质粒少量提取—CTAB法 | 第38-39页 |
| 2.2.5 酿酒酵母染色体快速提取 | 第39页 |
| 2.2.6 聚合酶链式反应（PCR反应） | 第39-42页 |
| 2.2.7 DNA的酶切与连接反应 | 第42-43页 |
| 2.2.8 酵母感受态细胞的制备与转化实验 | 第43-44页 |
| 2.2.9 纤维二糖发酵评价 | 第44页 |
| 2.2.10 发酵液组分的高效液相色谱分析（HPLC） | 第44-45页 |
| 2.2.11 β-葡萄糖苷酶酶活测定 | 第45-46页 |
| 2.2.12 蛋白质含量测定—Bradford蛋白质定量试剂盒 | 第46页 |
| 2.2.13 β-半乳糖苷酶酶活测定 | 第46-48页 |
| 2.2.14 CRISPR/Cas9系统的构建 | 第48-50页 |
| 2.2.15 CRISPR/Cas9系统的靶向流程 | 第50-52页 |
| 第3章 CRISPR/Cas9基因编辑技术在酵母工业菌株中的应用 | 第52-63页 |
| 3.1 Cas9基因表达载体YCplac33- Cas9构建 | 第52-56页 |
| 3.1.1 Cas9基因片段的制备 | 第53-54页 |
| 3.1.2 载体片段的制备 | 第54页 |
| 3.1.3 YCplac33- Cas9的构建 | 第54-56页 |
| 3.2 gRNA表达载体pRS- gRNA-HIS1构建 | 第56-57页 |
| 3.3 供体DNA片段合成 | 第57-58页 |
| 3.4 组氨酸营养缺陷型菌株An-a (?his1) 和W303-1A (?his1) 构建 | 第58-61页 |
| 3.4.1 宿主菌株潮霉素抗性水平测试 | 第58-59页 |
| 3.4.2 YCplac33-Cas9质粒转化 | 第59-60页 |
| 3.4.3 pRS-g RNA-HIS1和供体DNA片段共转化构建?his1菌株 | 第60-61页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第61-63页 |
| 3.5.1 小结 | 第61页 |
| 3.5.2 讨论 | 第61-63页 |
| 第4章 UPRE压力指示菌株构建和评价 | 第63-76页 |
| 4.1 gRNA表达载体pRS- gRNA-LEU2构建 | 第63-65页 |
| 4.2 含UPRE-Lac Z基因表达盒的供体DNA片段制备 | 第65-66页 |
| 4.3 An-a(leu2::UPRE-LacZ) 和W303-1A (leu2-3::UPRE-LacZ) 构建 | 第66-72页 |
| 4.3.1 An-a（leu2::UPRE-LacZ）压力指示菌株的构建 | 第67-69页 |
| 4.3.2 W303-1A（leu2-3::UPRE-LacZ）压力指示菌株的构建 | 第69-71页 |
| 4.3.3 压力指示菌株构建相关数据统计 | 第71-72页 |
| 4.4 An-a（leu2::UPRE-LacZ）和W303-1A（leu2-3::UPRE-LacZ）评价 | 第72-75页 |
| 4.4.1 生长评价 | 第72-73页 |
| 4.4.2 UPR信号响应评价 | 第73-75页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第75-76页 |
| 4.5.1 小结 | 第75页 |
| 4.5.2 讨论 | 第75-76页 |
| 第5章 β-葡萄糖苷酶锚定高表达代谢负担和UPR信号响应初步评价 | 第76-84页 |
| 5.1 YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶锚定和分泌表达菌株构建 | 第76页 |
| 5.2 以纤维二糖为碳源的生长、发酵产醇、酶活测定及UPR响应评价 | 第76-82页 |
| 5.2.1 2%纤维二糖、好氧条件下的生长、酶活测定和UPR响应观察 | 第77-78页 |
| 5.2.2 2%纤维二糖、限氧条件下的生长、产醇和UPR响应观察 | 第78-80页 |
| 5.2.3 10%纤维二糖、限氧条件下的生长、产醇和UPR响应观察 | 第80-82页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第82-84页 |
| 5.3.1 小结 | 第82-83页 |
| 5.3.2 讨论 | 第83-84页 |
| 第6章 结论与展望 | 第84-86页 |
| 6.1 结论 | 第84-85页 |
| 6.2 展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-90页 |
| 附录 | 第90-94页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
