| 致谢 | 第7-11页 |
| 缩略词表 | 第11-14页 |
| 摘要 | 第14-17页 |
| Abstract | 第17-20页 |
| 第一章 引言 | 第21-51页 |
| 1.1 表观遗传和肿瘤 | 第22-26页 |
| 1.1.1 表观修饰酶 | 第22-23页 |
| 1.1.2 非编码 RNA(non-coding RNAs,ncRNAs | 第23-26页 |
| 1.2 靶向肿瘤表观修饰酶的研究现状 | 第26-33页 |
| 1.3 PRC2/EZH2 和肿瘤的发生发展 | 第33-47页 |
| 1.3.1 PRC2 和 EZH2 生物学功能 | 第33-38页 |
| 1.3.2 靶向PRC2抑制剂的研究现状 | 第38-42页 |
| 1.3.3 目前靶向PRC2抑制剂的开发和研究方法 | 第42-47页 |
| 1.4 表观遗传领域抑制剂研发存在的问题 | 第47-49页 |
| 1.5 课题研究内容和方案 | 第49-51页 |
| 第二章 EZH2-EED 蛋白相互作用抑制剂高通量筛选平台的建立 | 第51-65页 |
| 2.1 基于 NanoBRET 方法,建立活细胞水平、高通量 EZH2-EED 蛋白蛋白相互作用抑制剂筛选平台 | 第51-58页 |
| 2.1.1 材料和方法 | 第53-56页 |
| 2.1.1.1 细胞和大肠杆菌的培养 | 第53页 |
| 2.1.1.2 试剂和耗材 | 第53-54页 |
| 2.1.1.3 主要实验仪器 | 第54页 |
| 2.1.1.4 表达质粒构建与验证 | 第54页 |
| 2.1.1.5 最佳质粒组合选择 | 第54-55页 |
| 2.1.1.6 质粒导入细胞最佳比例选择 | 第55-56页 |
| 2.1.2 结果 | 第56-58页 |
| 2.1.2.1 EZH2 FN31N+EED FC14H 为最佳质粒组合 | 第56-57页 |
| 2.1.2.2 EZH2 FN31N+EED FC14H 最佳质粒转染比例为 1:1 | 第57-58页 |
| 2.2 建立基于FP的分子水平高通量抑制剂筛选平台 | 第58-63页 |
| 2.2.1 材料和方法 | 第60-62页 |
| 2.2.1.1 主要试剂,耗材和实验仪器 | 第60页 |
| 2.2.1.2 EED蛋白表达质粒和蛋白表达纯化 | 第60-61页 |
| 2.2.1.3 多肽的合成 | 第61页 |
| 2.2.1.4 FP实验条件 | 第61-62页 |
| 2.2.2 结果 | 第62-63页 |
| 2.3 讨论 | 第63-65页 |
| 第三章 EZH2-EED 相互作用小分子抑制剂的发现及作用机制研究 | 第65-105页 |
| 3.1 材料和方法 | 第65-78页 |
| 3.1.1 细胞株和细胞培养 | 第65-66页 |
| 3.1.2 实验试剂,耗材和主要实验仪器 | 第66-68页 |
| 3.1.3 NanoBRET 检测 | 第68页 |
| 3.1.4 蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting) | 第68-69页 |
| 3.1.5 蛋白热迁移实验 | 第69页 |
| 3.1.6 全细胞热迁移实验 | 第69-70页 |
| 3.1.7 FP实验 | 第70页 |
| 3.1.8 磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)检测贴壁细胞增殖实验 | 第70-71页 |
| 3.1.9 CCK8检测悬浮细胞的增殖实验 | 第71页 |
| 3.1.10 RNA 提取和实时定量(real-time PCR)实验 | 第71-73页 |
| 3.1.11 细胞周期和凋亡检测 | 第73页 |
| 3.1.12 平板克隆形成实验 | 第73-74页 |
| 3.1.13 免疫荧光 | 第74页 |
| 3.1.14 迁移(Transwell)实验 | 第74-75页 |
| 3.1.15 细胞划痕实验 | 第75页 |
| 3.1.16 逆转录和 qRT-PCR 检测基因 miRNAs 表达水平 | 第75-76页 |
| 3.1.17 双荧光素酶报告基因系统检测 | 第76-77页 |
| 3.1.18免疫共沉淀实验 | 第77-78页 |
| 3.1.19 统计方法 | 第78页 |
| 3.2 结果 | 第78-103页 |
| 3.2.1 AZD9291 干扰 EZH2-EED 蛋白之间的相互作用 | 第78-81页 |
| 3.2.2 AZD9291特异性抑制H3K27甲基化 | 第81-83页 |
| 3.2.3 AZD9291 影响 EZH2-EED 的蛋白相互作用不依赖于 EGFR | 第83-85页 |
| 3.2.4 AZD9291的抗肿瘤作用 | 第85-88页 |
| 3.2.4.1 AZD9291抑制肿瘤细胞增殖 | 第85-87页 |
| 3.2.4.2 AZD9291抑制肿瘤细胞体外运动 | 第87页 |
| 3.2.4.3 AZD9291诱导细胞自噬 | 第87-88页 |
| 3.2.5 AZD9291 直接促进 EZH2 蛋白的泛素化降解 | 第88-91页 |
| 3.2.6 AZD9291 促进 EZH2 蛋白降解,不依赖 EGFR 下游信号通路 | 第91-93页 |
| 3.2.7 AZD9291 通过上调 micRNAs,抑制 EZH2 mRNA 的表达 | 第93-95页 |
| 3.2.7.1 AZD9291 下调 EZH2 mRNA | 第93页 |
| 3.2.7.2 AZD9291 通过影响 miR-34a,抑制 EZH2 mRNA | 第93-95页 |
| 3.2.8 miR-34a 可模拟 AZD9291 对肿瘤细胞的多种生物学效应 | 第95-98页 |
| 3.2.9 miR-34a 可能通过非经典的方式靶向 EZH2 的 3’UTR,调节 EZH2 mRNA的表达 | 第98-99页 |
| 3.2.10 AZD9291 通过上调 miR-3157,下调 EZH2 的 mRNA | 第99-103页 |
| 3.2.10.1 miR-3157 靶向 EZH2 | 第99-101页 |
| 3.2.10.2 AZD9291 上调 miR-3157 发挥抗肿瘤作用 | 第101-103页 |
| 3.3 讨论 | 第103-105页 |
| 总结 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-119页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第119-120页 |
| 附录 就读期间参加的学术会议 | 第120页 |
| 附表 1:检测 MDA-MB-453 细胞中miRNAs表达的变化 | 第120-122页 |
