| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-19页 |
| 1 PEDV的研究进展 | 第10-18页 |
| 1.1 PEDV的生物学特性 | 第10-14页 |
| 1.1.1 PEDV的病原学 | 第10-11页 |
| 1.1.2 PEDV基因组结构 | 第11页 |
| 1.1.3 PEDV的非结构基因 | 第11-12页 |
| 1.1.4 PEDV的结构基因和其编码产物 | 第12-14页 |
| 1.2 PEDV的流行病学特点 | 第14页 |
| 1.3 PEDV的实验室诊断方法 | 第14-15页 |
| 1.3.1 病原学诊断 | 第14页 |
| 1.3.2 血清学诊断 | 第14-15页 |
| 1.3.3 常规RT-PCR法 | 第15页 |
| 1.4 荧光定量PCR | 第15-18页 |
| 1.4.1 荧光定量PCR原理 | 第15-16页 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR中的荧光化学物质 | 第16-18页 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR的定量方法 | 第18页 |
| 2 本试验的研究目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 PEDV常规RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第19-28页 |
| 1 材料 | 第19-20页 |
| 1.1 病料的来源 | 第19页 |
| 1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 1.3 常用试剂的配制 | 第19-20页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第20页 |
| 2 方法 | 第20-23页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第20页 |
| 2.2 RNA的提取 | 第20-21页 |
| 2.3 RT-PCR | 第21页 |
| 2.3.1 cDNA的合成 | 第21页 |
| 2.3.2 PCR扩增 | 第21页 |
| 2.4 目的产物纯化 | 第21-22页 |
| 2.5 目的产物的连接与转化 | 第22页 |
| 2.5.1 目的片段的T-A克隆 | 第22页 |
| 2.5.2 连接产物的转化 | 第22页 |
| 2.6 重组菌的筛选与鉴定 | 第22-23页 |
| 2.6.1 重组菌的扩大培养 | 第22页 |
| 2.6.2 菌落PCR | 第22-23页 |
| 2.6.3 重组菌测序鉴定 | 第23页 |
| 2.7 PCR的条件优化 | 第23页 |
| 2.7.1 特异性实验 | 第23页 |
| 2.7.2 最佳退火温度的优化 | 第23页 |
| 2.7.3 最佳引物浓度的优化 | 第23页 |
| 2.7.4 敏感性实验 | 第23页 |
| 2.8 临床检测 | 第23页 |
| 3 结果 | 第23-26页 |
| 3.1 PCR的条件优化结果 | 第23-25页 |
| 3.1.1 特异性实验 | 第23-24页 |
| 3.1.2 最佳退火温度的确定 | 第24页 |
| 3.1.3 最佳引物浓度的确定 | 第24-25页 |
| 3.1.4 敏感性实验 | 第25页 |
| 3.2 目的片段的序列分析 | 第25-26页 |
| 3.3 临床样品的检测 | 第26页 |
| 4 小结与讨论 | 第26-28页 |
| 第三章 PEDV SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 | 第28-37页 |
| 1 材料 | 第28-29页 |
| 1.1 病料的来源 | 第28页 |
| 1.2 主要试剂 | 第28页 |
| 1.3 常用试剂的配制 | 第28-29页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-32页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第29页 |
| 2.2 RNA的提取 | 第29页 |
| 2.3 SYBR Green I荧光定量PCR标准品的制备 | 第29-31页 |
| 2.3.1 RT-PCR | 第29页 |
| 2.3.2 目的产物纯化 | 第29页 |
| 2.3.3 目的产物的连接与转化 | 第29页 |
| 2.3.4 重组菌的筛选与鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3.5 阳性质粒的提取 | 第30页 |
| 2.3.6 阳性质粒的酶切鉴定 | 第30页 |
| 2.3.7 标准品的制备 | 第30-31页 |
| 2.4 SYBR Green I荧光定量PCR反应体系的建立及优化 | 第31页 |
| 2.5 SYBR Green I标准曲线的建立 | 第31页 |
| 2.6 溶解曲线的分析 | 第31页 |
| 2.7 SYBR Green I特异性、敏感性和稳定性试验 | 第31页 |
| 2.8 SYBR Green I实时荧光定量PCR的应用 | 第31-32页 |
| 3 结果 | 第32-35页 |
| 3.1 目的片段的扩增及重组质粒的鉴定 | 第32页 |
| 3.2 SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的确定和标准曲线的建立 | 第32-33页 |
| 3.3 SYBR Green I实时荧光定量PCR的溶解曲线分析 | 第33-34页 |
| 3.4 SYBR Green I荧光定量PCR特异性、敏感性和稳定性试验结果 | 第34-35页 |
| 3.5 临床样品的检测 | 第35页 |
| 4 小结与讨论 | 第35-37页 |
| 第四章 PEDV Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 | 第37-45页 |
| 1 材料 | 第37-38页 |
| 1.1 病料的来源 | 第37页 |
| 1.2 主要试剂 | 第37页 |
| 1.3 常用试剂的配制 | 第37-38页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第38页 |
| 2 方法 | 第38-40页 |
| 2.1 Taq-Man实时荧光定量PCR的引物与探针设计与合成 | 第38页 |
| 2.2 RNA的提取 | 第38页 |
| 2.3 Taq-Man实时荧光定量PCR标准品的制备 | 第38-39页 |
| 2.3.1 RT-PCR | 第38页 |
| 2.3.2 目的产物纯化 | 第38页 |
| 2.3.3 目的产物的连接与转化 | 第38页 |
| 2.3.4 重组菌的筛选与鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.5 阳性质粒的提取 | 第39页 |
| 2.3.6 阳性质粒的酶切鉴定 | 第39页 |
| 2.3.7 标准品的制备 | 第39页 |
| 2.4 Taq-Man实时荧光定量PCR反应体系的建立及优化 | 第39页 |
| 2.5 Taq-Man实时荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第39页 |
| 2.6 Taq-Man实时荧光定量PCR特异性、敏感性和稳定性试验 | 第39-40页 |
| 2.7 Taq-Man实时荧光定量PCR的临床运用 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-43页 |
| 3.1 目的片段的扩增及重组质粒的鉴定 | 第40页 |
| 3.2 Taq-Man实时荧光定量PCR反应条件的确定和标准曲线的建立 | 第40-41页 |
| 3.3 Taq-Man实时荧光定量PCR特异性、敏感性和稳定性试验结果 | 第41-42页 |
| 3.4 临床样品的检测 | 第42-43页 |
| 4 小结与讨论 | 第43-45页 |
| 第五章 应用Taq-Man实时荧光定量PCR探究PEDV疫苗株的培养及增殖规律 | 第45-53页 |
| 1 材料 | 第45-46页 |
| 1.1 材料来源 | 第45页 |
| 1.2 主要试剂 | 第45页 |
| 1.3 常用试剂的配制 | 第45-46页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-48页 |
| 2.1 Vero-81细胞复苏 | 第46页 |
| 2.2 Vero-81细胞的传代培养 | 第46页 |
| 2.3 PEDV疫苗株CV777的增殖 | 第46-47页 |
| 2.4 PEDV疫苗株CV777的Taq-Man实时荧光定量PCR定量 | 第47页 |
| 2.4.1 RNA的提取 | 第47页 |
| 2.4.2 Taq-Man实时荧光定量PCR | 第47页 |
| 2.5 病毒TCID50的测定 | 第47页 |
| 2.6 PEDV疫苗株CV777一步生长曲线的绘制 | 第47-48页 |
| 3 结果 | 第48-51页 |
| 3.1 Vero-81细胞的培养 | 第48页 |
| 3.2 PEDV CV777疫苗株的培养 | 第48-49页 |
| 3.3 CV777拷贝数和滴度的测定 | 第49-50页 |
| 3.3.1 拷贝数的测定 | 第49页 |
| 3.3.2 TCID50的测定 | 第49-50页 |
| 3.4 CV777一步生长曲线的绘制 | 第50-51页 |
| 4 小结与讨论 | 第51-53页 |
| 全文总结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-60页 |
| 致谢 | 第60页 |
