| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 前言 | 第14-29页 |
| 1 OGT的研究概述 | 第14-19页 |
| 1.1 OGT与蛋白质的0-GlcNAc修饰 | 第14页 |
| 1.2 OGT的结构与分类 | 第14-16页 |
| 1.3 生物学功能 | 第16-17页 |
| 1.4 O-GlcNAc与疾病的关系 | 第17-19页 |
| 1.4.1 O-GlcNAc与糖尿病的关系 | 第17-18页 |
| 1.4.2 O-GlcNAc与神经退行性疾病的关系 | 第18页 |
| 1.4.3 O-GlcNAc与肿瘤的关系 | 第18-19页 |
| 2 检测O-GlcNac糖基转移酶的方法 | 第19-25页 |
| 2.1 利用放射性标记的OGT的糖基供体底物-UDP-GlcNAc检测 | 第19-20页 |
| 2.2 使用O-GlcNAc抗体的检测方法 | 第20页 |
| 2.3 使用凝集素法检测 | 第20-21页 |
| 2.4 高通量的测定方法 | 第21-23页 |
| 2.4.1 荧光的UDP-GlcNAc类似物的置换试验 | 第21-22页 |
| 2.4.2 “蛋白酶-保护”分析策略 | 第22-23页 |
| 2.5 叠氮酶联免疫吸附测定 | 第23-25页 |
| 3 多抗的制备原则 | 第25-27页 |
| 3.1 抗原的选择 | 第25-26页 |
| 3.2 人工抗原的合成 | 第26-27页 |
| 4 本论文的研究目的与意义 | 第27-29页 |
| 第一章 OGT-C原核表达与蛋白纯化 | 第29-44页 |
| 1 实验材料 | 第29-32页 |
| 1.1 菌株与载体 | 第29页 |
| 1.2 主要仪器与设备 | 第29-30页 |
| 1.3 试剂 | 第30页 |
| 1.4 主要溶液的配制 | 第30-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-40页 |
| 2.1 OGT-C重组表达载体的构建 | 第32-38页 |
| 2.1.1 OGT-C末端556-1046aa的引物设计 | 第33页 |
| 2.1.2 PCR扩增OGT-C_(556-1046aa)序列 | 第33-34页 |
| 2.1.3 DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段 | 第34-35页 |
| 2.1.4 OGT-C_(556-1046)基因片段连接pMD18-T载体 | 第35页 |
| 2.1.5 转化 | 第35-36页 |
| 2.1.6 碱裂解法提取质粒 | 第36页 |
| 2.1.7 OGT-CC_(556-1046)基因片段连接pET30-a载体 | 第36-37页 |
| 2.1.8 酶切鉴定重组质粒 | 第37-38页 |
| 2.2 OGT-C重组蛋白的原核表达 | 第38-40页 |
| 2.2.1 优化OGT-C重组蛋白的表达条件 | 第38页 |
| 2.2.2 样品的制备及处理 | 第38-39页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳 | 第39-40页 |
| 2.3 抗原蛋白的纯化 | 第40页 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 | 第40页 |
| 2.3.2 包涵体的裂解 | 第40页 |
| 2.3.3 NAT亲和层析纯化重组蛋白 | 第40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-42页 |
| 3.1 OGT-C重组表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.2 OGT-C重组蛋白的原核表达与纯化 | 第41-42页 |
| 4 小结 | 第42-44页 |
| 第二章 OGT-C多克隆抗体的制备与特异性分析 | 第44-56页 |
| 1 实验材料 | 第44-48页 |
| 1.1 仪器与设备 | 第44页 |
| 1.2 主要试剂 | 第44-46页 |
| 1.3 实验动物 | 第46页 |
| 1.4 细胞及质粒 | 第46页 |
| 1.5 主要溶液的配制 | 第46-48页 |
| 2 实验方法 | 第48-52页 |
| 2.1 免疫动物 | 第48-49页 |
| 2.2 间接ELISA法检测抗体效价 | 第49页 |
| 2.3 Western blotting鉴定抗体特异性 | 第49-52页 |
| 2.3.1 细胞培养 | 第49-50页 |
| 2.3.2 转染 | 第50页 |
| 2.3.3 样品制备 | 第50页 |
| 2.3.4 Western blotting | 第50-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-54页 |
| 3.1 间接ELISA法检测OGT-C多克隆抗体的效价 | 第52-53页 |
| 3.2 Western blotting检测OGT-C多克隆抗体的特性 | 第53-54页 |
| 4 小结 | 第54-56页 |
| 第三章 mOGT多克隆抗体的制备 | 第56-71页 |
| 1 材料 | 第56-58页 |
| 1.1 主要仪器 | 第56页 |
| 1.2 主要试剂 | 第56页 |
| 1.3 主要溶液的配制 | 第56-58页 |
| 1.4 实验动物 | 第58页 |
| 1.5 细胞及质粒 | 第58页 |
| 2 方法 | 第58-63页 |
| 2.1 抗原片段的选择 | 第58页 |
| 2.2 抗原片段的合成与鉴定分析 | 第58-59页 |
| 2.3 mOGT多克隆抗体的制备 | 第59页 |
| 2.4 间接ELISA法检测抗体效价 | 第59-60页 |
| 2.4.1 初次检测抗体效价 | 第59-60页 |
| 2.4.2 ELISA间接法检测抗m-2免疫血清的效价 | 第60页 |
| 2.5 Western blotting鉴定抗体特异性 | 第60-63页 |
| 2.5.1 细胞培养及转染 | 第60-61页 |
| 2.5.2 转化及诱导表达 | 第61页 |
| 2.5.3 样品制备 | 第61页 |
| 2.5.4 Western blotting | 第61-63页 |
| 3 结果与分析 | 第63-69页 |
| 3.1 抗原片段的合成与鉴定 | 第63-66页 |
| 3.1.1 合成多肽的高效液相色谱(HPLC)分析 | 第63-64页 |
| 3.1.2 合成多肽质谱(MS)分析 | 第64-66页 |
| 3.2 多抗的制备与特异性分析 | 第66-69页 |
| 3.2.1 免疫血清效价的初步测定 | 第66-67页 |
| 3.2.2 间接ELISA法检测m-2免疫血清的效价 | 第67-68页 |
| 3.2.3 Western blotting | 第68-69页 |
| 4 小结 | 第69-70页 |
| 5 展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 附录 | 第77-80页 |
| 附录1 常用分子生物学实验方法 | 第77-79页 |
| 附录2 缩略词汇总 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 个人简历 | 第81页 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第81页 |
