| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-21页 |
| 1 PRRSV基因组与结构蛋白的特点与功能 | 第10-17页 |
| ·PRRSV基因组 | 第10-11页 |
| ·结构蛋白 | 第11-14页 |
| ·GP2、GP3、GP4的特点与功能 | 第11页 |
| ·GP5的特点与功能 | 第11-13页 |
| ·M蛋白特点与功能 | 第13页 |
| ·N蛋白特点与功能 | 第13-14页 |
| ·PRRS的防制 | 第14-17页 |
| ·PRRS防制的策略 | 第14-15页 |
| ·疫苗研究进展 | 第15-17页 |
| 2 分子伴侣Hsp70在核酸疫苗中应用的研究 | 第17-21页 |
| ·热休克蛋白70(Hsp70) | 第17页 |
| ·热休克蛋白70重要功能 | 第17-19页 |
| ·分子伴侣功能 | 第18页 |
| ·增强免疫反应功能 | 第18-19页 |
| ·Hsp70嵌合DNA疫苗 | 第19页 |
| ·小结 | 第19-21页 |
| 第二章 核酸疫苗的构建及鉴定 | 第21-49页 |
| 1 材料 | 第21-23页 |
| ·载体和菌株 | 第21页 |
| ·试剂与引物 | 第21-23页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·溶液配制 | 第21-22页 |
| ·引物(上海英俊公司合成) | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-36页 |
| ·PRRSV ORF7基因的PCR、克隆及鉴定 | 第23-26页 |
| ·PRRSV的总RNA的提取 | 第23页 |
| ·RT-PCR扩增ORF7A(含终止子)和ORF7B(不含终止子) | 第23-25页 |
| ·目的基因ORF7A和ORF7B的回收 | 第25页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态细胞的制各 | 第25页 |
| ·ORF7A和ORF7B的连接与转化 | 第25-26页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第26页 |
| ·序列测定 | 第26页 |
| ·PRRSV ORF5基因的PCR、克隆及鉴定 | 第26-28页 |
| ·pMD-PRRSV ORF5基因的PCR | 第27页 |
| ·目的基因ORF5的回收 | 第27页 |
| ·ORF5的连接与转化 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第28页 |
| ·序列测定 | 第28页 |
| ·结核分枝杆菌Hsp70基因的PCR、克隆及鉴定 | 第28-32页 |
| ·pMD-Hsp70基因的PCR | 第28-29页 |
| ·目的基因Hsp70的回收 | 第29页 |
| ·Hsp70的连接与转化 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第30页 |
| ·序列测定 | 第30-32页 |
| ·重组质粒pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的构建 | 第32-33页 |
| ·PRRSV ORF7A和ORF7B DNA的获得 | 第32页 |
| ·含PRRSV ORF5基因的pMD19-T Simple开环载体的准备 | 第32页 |
| ·PRRSV ORF5基因分别与ORF7A及ORF7B基因的连接及转化 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第33页 |
| ·序列测定 | 第33页 |
| ·构建重组质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B | 第33-35页 |
| ·PRRSV ORF5-ORF7A和ORF5-ORF7B DNA的获得 | 第33-34页 |
| ·真核表达载体pCI-neo开环线性化准备 | 第34页 |
| ·pCI-neo分别与ORF5-ORF7A和ORF5-ORF7B的连接及转化 | 第34页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第34-35页 |
| ·构建真核表达质粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70 | 第35-36页 |
| ·结核分枝杆菌Hsp70 DNA的获得 | 第35页 |
| ·pCI-ORF5-ORF7B开环线性化准备 | 第35页 |
| ·Hsp70与pCI-ORF5-ORF7B连接及转化 | 第35页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白二级结构预测 | 第36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-44页 |
| ·pMD-ORF7A和pMD-ORF7B的构建 | 第36-37页 |
| ·PRRSV ORF7基因的PCR扩增 | 第36页 |
| ·PCR及酶切鉴定 | 第36-37页 |
| ·序列测定 | 第37页 |
| ·pMD-ORF5的构建 | 第37-38页 |
| ·PRRSV ORF5基因的PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·酶切鉴定 | 第38页 |
| ·序列测定 | 第38页 |
| ·结核分枝杆菌pMD-Hsp70的构建 | 第38-39页 |
| ·结核分枝杆菌Hsp70基因的PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·酶切鉴定 | 第39页 |
| ·序列测定 | 第39页 |
| ·重组质粒pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的构建 | 第39-40页 |
| ·pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的PCR鉴定 | 第39-40页 |
| ·pMD-ORF5-ORF7A和pMD-ORF5-ORF7B的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·序列测定 | 第40页 |
| ·构建重组质粒pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B | 第40-41页 |
| ·构建真核表达质粒pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白的二级结构预测结果 | 第42-44页 |
| ·Linker柔性分析 | 第42页 |
| ·表位分析 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44-48页 |
| ·核酸疫苗的目的基因选择 | 第44-46页 |
| ·真核表达载体的选择 | 第46-47页 |
| ·核酸疫苗构建策略 | 第47-48页 |
| 5 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 动物免疫实验 | 第49-61页 |
| 1 材料 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49页 |
| 2 方法 | 第49-53页 |
| ·小白鼠免疫试验 | 第49-50页 |
| ·pCI-ORF5-ORF7A和pCI-ORF5-ORF7B-Hsp70质粒的制备 | 第49页 |
| ·质粒DNA的免疫 | 第49-50页 |
| ·血样的采集 | 第50页 |
| ·免疫试验指标检测 | 第50-53页 |
| ·小鼠体内mRNA表达检测 | 第50页 |
| ·PRRSV抗体检测 | 第50-51页 |
| ·T淋巴细胞亚群数量检测 | 第51页 |
| ·小鼠体内IFN-γ分泌水平检测 | 第51-52页 |
| ·小鼠体内IL-4分泌水平检测 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-57页 |
| ·小鼠体内mRNA表达检测 | 第53-54页 |
| ·小鼠体内PRRSV抗体检测结果 | 第54-55页 |
| ·小鼠体内IFN-γ和IL-4分泌水平检测结果 | 第55-56页 |
| ·T淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+和CD8~+水平检测结果 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录 | 第70-74页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第74页 |
