| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 绪论 | 第11-18页 |
| 1.1 漆酶的特征及结构 | 第11-12页 |
| 1.1.1 漆酶的来源 | 第11页 |
| 1.1.2 微生物漆酶的理化特征 | 第11页 |
| 1.1.3 微生物漆酶的结构 | 第11-12页 |
| 1.2 常用基因异源表达系统 | 第12-14页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统 | 第12-13页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| 1.3 漆酶基因克隆表达的国内外研究现状 | 第14-15页 |
| 1.4 漆酶的应用进展 | 第15-16页 |
| 1.4.1 环境治理 | 第15-16页 |
| 1.4.2 食品工业中的应用 | 第16页 |
| 1.4.3 造纸工业 | 第16页 |
| 1.4.4 农业 | 第16页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第16-17页 |
| 1.6 课题的研究内容 | 第17-18页 |
| 2 产漆酶菌株的筛选及鉴定 | 第18-30页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.2 仪器与设备 | 第18-19页 |
| 2.1.3 培养基 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-22页 |
| 2.2.1 样品采集 | 第19页 |
| 2.2.2 产漆酶菌株的分离及初筛 | 第19页 |
| 2.2.3 产漆酶菌株的复筛 | 第19页 |
| 2.2.4 漆酶的酶活测定方法 | 第19-20页 |
| 2.2.5 细菌形态观察及生理生化鉴定 | 第20页 |
| 2.2.6 真菌菌落形态观察 | 第20页 |
| 2.2.7 产漆酶细菌的16SrDNA分子生物学鉴定 | 第20-22页 |
| 2.2.8 产漆酶真菌的rDNA-ITS序列分子生物学鉴定 | 第22页 |
| 2.2.9 基因序列测定及序列分析 | 第22页 |
| 2.3 结果与分析 | 第22-29页 |
| 2.3.1 产漆酶细菌的分离与初步筛选 | 第22-23页 |
| 2.3.2 产漆酶真菌的分离与初筛 | 第23页 |
| 2.3.3 产漆酶菌种的酶活力复筛 | 第23-24页 |
| 2.3.4 产漆酶细菌的形态学及生理生化鉴定 | 第24-25页 |
| 2.3.5 QM11的分子生物学鉴定 | 第25-27页 |
| 2.3.6 真菌Z6的鉴定 | 第27-29页 |
| 2.4 本章小结 | 第29-30页 |
| 3 QM11及Z6漆酶基因的克隆及序列分析 | 第30-46页 |
| 3.1 实验材料与仪器 | 第30-31页 |
| 3.1.1 菌种及载体 | 第30页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第30页 |
| 3.1.3 仪器与设备 | 第30页 |
| 3.1.4 培养基 | 第30-31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-34页 |
| 3.2.1 QM11菌株漆酶cotA基因的克隆 | 第31-32页 |
| 3.2.2 Z6菌株漆酶lac1基因的克隆 | 第32-34页 |
| 3.2.3 cotA,lac1基因的序列分析 | 第34页 |
| 3.3 结果与分析 | 第34-45页 |
| 3.3.1 QM11菌株基因组DNA的提取及其cotA基因的扩增 | 第34-35页 |
| 3.3.2 重组克隆质粒pMD18T-cotA的构建 | 第35页 |
| 3.3.3 cotA基因的序列分析 | 第35-39页 |
| 3.3.4 Z6总RNA的提取及lac1基因的扩增 | 第39-40页 |
| 3.3.5 重组克隆载体pMD18T-lac1的构建 | 第40-41页 |
| 3.3.6 lac1基因的序列分析 | 第41-45页 |
| 3.4 本章小结 | 第45-46页 |
| 4 cotA基因及lac1基因的异源表达 | 第46-56页 |
| 4.1 实验材料与仪器 | 第46-47页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第46页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第46-47页 |
| 4.1.3 仪器与设备 | 第47页 |
| 4.1.4 培养基 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-51页 |
| 4.2.1 pET22b-cotA表达载体的构建及鉴定 | 第47-48页 |
| 4.2.2 cotA基因重组菌株的诱导表达 | 第48-49页 |
| 4.2.3 SDS-PAGE电泳检测 | 第49页 |
| 4.2.4 pPIC9K-lac1表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 4.2.5 毕赤酵母感受态的制备和转化 | 第50-51页 |
| 4.2.6 酵母表型的筛选及PCR鉴定 | 第51页 |
| 4.2.7 重组酵母的诱导表达 | 第51页 |
| 4.3 结果与分析 | 第51-55页 |
| 4.3.1 重组质粒pET22b-cotA的构建及鉴定 | 第51-52页 |
| 4.3.2 cotA基因的诱导表达 | 第52-53页 |
| 4.3.3 重组质粒pPIC9K-lac1的构建和鉴定 | 第53页 |
| 4.3.4 酵母的电转化及重组子的筛选 | 第53-54页 |
| 4.3.5 lac1基因的诱导表达及活性检测 | 第54-55页 |
| 4.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 5 重组漆酶cotA蛋白的纯化及酶学性质的研究 | 第56-65页 |
| 5.1 实验材料与仪器 | 第56-57页 |
| 5.1.1 菌种 | 第56页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第56页 |
| 5.1.3 仪器与设备 | 第56页 |
| 5.1.4 重组蛋白纯化所用溶液 | 第56-57页 |
| 5.2 实验方法 | 第57-59页 |
| 5.2.1 诱导温度的选择 | 第57页 |
| 5.2.2 粗酶液的制备 | 第57页 |
| 5.2.3 镍柱亲和柱层析纯化 | 第57页 |
| 5.2.4 SDS-PAGE电泳分析 | 第57页 |
| 5.2.5 重组cotA蛋白浓度的测定 | 第57-58页 |
| 5.2.6 纯化倍数及回收率的计算 | 第58页 |
| 5.2.7 重组漆酶cotA蛋白的酶学性质研究 | 第58-59页 |
| 5.3 结果与分析 | 第59-64页 |
| 5.3.1 诱导时间的确定 | 第59页 |
| 5.3.2 cotA蛋白的分离纯化 | 第59-61页 |
| 5.3.3 cotA蛋白的酶学性质研究 | 第61-64页 |
| 5.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 结论 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
