| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1. AIV的重要分子生物学特征 | 第14-15页 |
| 1.1 AIV及其分类地位 | 第14页 |
| 1.2 AIV的形态与结构 | 第14-15页 |
| 1.3 AIV基因结构与编码排布 | 第15页 |
| 2. ALV的重要分子生物学特征 | 第15-17页 |
| 2.1 ALV及其分类地位 | 第15-16页 |
| 2.2 ALV的形态与结构 | 第16页 |
| 2.3 ALV的基因组结构与编码排布 | 第16-17页 |
| 3. IBV的重要分子生物学特征 | 第17-19页 |
| 3.1 IBV的分类地位及形态特征 | 第17-18页 |
| 3.2 IBV基因组结构 | 第18页 |
| 3.3 IBV基因组编码的蛋白质 | 第18-19页 |
| 4. IBDV的重要分子生物学特征 | 第19-21页 |
| 4.1 IBDV及其分类地位 | 第19页 |
| 4.2 IBDV的基因组与蛋白质 | 第19-21页 |
| 5. 常用病毒检测技术简介 | 第21-26页 |
| 5.1 病毒分离培养 | 第21-22页 |
| 5.1.1 鸡胚培养 | 第21页 |
| 5.1.2 细胞培养 | 第21-22页 |
| 5.2 电子显微术 | 第22页 |
| 5.3 血清学检测 | 第22-24页 |
| 5.3.1 血凝和血凝抑制试验 | 第22页 |
| 5.3.2 琼脂免疫扩散试验 | 第22-23页 |
| 5.3.3 酶联免疫吸附试验 | 第23页 |
| 5.3.4 胶体金免疫层析实验 | 第23页 |
| 5.3.5 免疫荧光技术 | 第23-24页 |
| 5.4 分子生物学方法 | 第24-26页 |
| 5.4.1 聚合酶链式反应 | 第24页 |
| 5.4.2 荧光定量RT-PCR | 第24-25页 |
| 5.4.3 依赖核酸序列的扩增技术 | 第25页 |
| 5.4.4 环介导等温扩增法 | 第25页 |
| 5.4.5 核酸杂交 | 第25-26页 |
| 5.4.6 基因芯片技术 | 第26页 |
| 6. 多重PCR技术在病原检测中的应用进展 | 第26-28页 |
| 第二章 实验方法 | 第28-42页 |
| 1. 实验材料 | 第28-32页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 1.2 主要试剂 | 第29页 |
| 1.3 溶液与缓冲液 | 第29-30页 |
| 1.4 培养基 | 第30页 |
| 1.5 细胞 | 第30页 |
| 1.6 病毒 | 第30-31页 |
| 1.7 菌株 | 第31页 |
| 1.8 野鸟 | 第31页 |
| 1.9 引物 | 第31-32页 |
| 2. 实验方法 | 第32-42页 |
| 2.1 DF-1细胞培养 | 第32页 |
| 2.2 病毒增殖 | 第32页 |
| 2.3 病毒RNA提取 | 第32-33页 |
| 2.4 感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.5 病毒滴度测定 | 第33-34页 |
| 2.5.1 细胞铺板 | 第33页 |
| 2.5.2 病毒稀释 | 第33页 |
| 2.5.3 接种病毒 | 第33-34页 |
| 2.6 ALV纯化 | 第34页 |
| 2.7 阳性对照质粒构建 | 第34-36页 |
| 2.7.1 逆转录 | 第34-35页 |
| 2.7.2 PCR | 第35页 |
| 2.7.3 PCR产物回收 | 第35页 |
| 2.7.4 基因克隆 | 第35页 |
| 2.7.4.1 连接 | 第35页 |
| 2.7.4.2 转化 | 第35页 |
| 2.7.5 阳性克隆鉴定 | 第35-36页 |
| 2.7.5.1 菌液PCR | 第35页 |
| 2.7.5.2 质粒提取 | 第35-36页 |
| 2.7.5.3 Bam H Ⅰ和HindⅢ双酶切 | 第36页 |
| 2.8 多重PCR条件的优化 | 第36-39页 |
| 2.8.1 退火温度优化 | 第36页 |
| 2.8.2 引物比例优化 | 第36-37页 |
| 2.8.3 引物浓度优化 | 第37页 |
| 2.8.4 缓冲液浓度条件的优化 | 第37-38页 |
| 2.8.5 Taq酶浓度条件优化 | 第38页 |
| 2.8.6 Mg~(2+)浓度条件优化 | 第38-39页 |
| 2.8.7 dNTP浓度 | 第39页 |
| 2.9 灵敏度检测 | 第39-40页 |
| 2.9.1 四重PCR灵敏度检测 | 第39页 |
| 2.9.2 四重RT-PCR灵敏度检测 | 第39-40页 |
| 2.10 四重PCR特异性检测 | 第40页 |
| 2.10.1 四重PCR特异性 | 第40页 |
| 2.10.2 四重RT-PCR特异性 | 第40页 |
| 2.11 四重RT-PCR实用性 | 第40页 |
| 2.12 野鸟中AIV、ALV、IBV和IBDV带毒状态四重RT-PCR检测 | 第40-41页 |
| 2.12.1 鸟类组织解剖 | 第40页 |
| 2.12.2 鸟类组织样品处理 | 第40-41页 |
| 2.12.3 四重RT-PCR检测 | 第41页 |
| 2.13 家禽市场粪便中AIV、ALV、IBV和IBDV带毒状态四重RT-PCR检测 | 第41-42页 |
| 第三章 实验结果 | 第42-64页 |
| 1. AIV、ALV、IBV、IBDV细胞病变效应 | 第42页 |
| 2. 病毒效价 | 第42-45页 |
| 2.1 AIV培养液滴度 | 第43页 |
| 2.2 IBV培养液滴度 | 第43-44页 |
| 2.3 IBDV培养液滴度 | 第44-45页 |
| 3. 纯化ALV浓度 | 第45页 |
| 4. AIV、ALV、IBV和IBDV基因阳性对照质粒克隆 | 第45-48页 |
| 4.1 RT-PCR扩增 | 第45-47页 |
| 4.2 阳性克隆双酶切验证 | 第47-48页 |
| 4.3 阳性克隆测序 | 第48页 |
| 5. 四重PCR最佳反应条件 | 第48-56页 |
| 5.1 四重PCR最佳退火温度 | 第48-51页 |
| 5.2 四重PCR最佳引物比例 | 第51-53页 |
| 5.2.1 AIV与IBDV最佳引物比例 | 第51页 |
| 5.2.2 ALV与IBDV最佳引物比例 | 第51-52页 |
| 5.2.3 IBV与IBDV最佳引物比例 | 第52页 |
| 5.2.4 AIV/ALV/IBV/IBDV最佳引物比例 | 第52-53页 |
| 5.3 最佳引物浓度 | 第53-54页 |
| 5.4 最佳Buffer浓度 | 第54页 |
| 5.5 最佳Taq DNA聚合酶浓度 | 第54-55页 |
| 5.6 最佳Mg~(2+)浓度 | 第55-56页 |
| 5.7 最佳dNTP浓度 | 第56页 |
| 6. 四重RT-PCR的检测灵敏度 | 第56-60页 |
| 6.1 四重PCR的检测灵敏度 | 第56-58页 |
| 6.2 四重RT-PCR的检测灵敏度 | 第58-60页 |
| 7. 特异性 | 第60-62页 |
| 7.1 四重PCR特异性 | 第60-61页 |
| 7.2 四重RT-PCR特异性 | 第61-62页 |
| 8. 实用性 | 第62页 |
| 9. 野鸟感染情况 | 第62-63页 |
| 10. 家禽粪便检测 | 第63-64页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第64-74页 |
| 1. 四重RT-PCR影响因素 | 第64-65页 |
| 2. 灵敏度的比较 | 第65-67页 |
| 3. 病毒的相互干扰 | 第67-72页 |
| 3.1 AIV对ALV、IBV、IBDV的干扰 | 第67-69页 |
| 3.2 ALV对AIV、IBV、IBDV的干扰 | 第69-70页 |
| 3.3 IBV对AIV、ALV、IBDV的干扰 | 第70-71页 |
| 3.4 IBDV对AIV、ALV、IBV的干扰 | 第71-72页 |
| 4. 野生鸟类检测结果的流行病学意义 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-79页 |
| 在校期间发表的和待发表的论文 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
