| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 1 引言 | 第11-20页 |
| 1.1 牛支原体病简介 | 第11页 |
| 1.2 牛支原体病原学特性 | 第11-13页 |
| 1.2.1 牛支原体的分类及形态学特征 | 第11-12页 |
| 1.2.2 牛支原体的培养特性 | 第12页 |
| 1.2.3 牛支原体的生化特性 | 第12-13页 |
| 1.2.4 牛支原体的抵抗力 | 第13页 |
| 1.3 牛支原体病的流行病学 | 第13-14页 |
| 1.4 牛支原体的致病机理 | 第14-15页 |
| 1.5 牛支原体的免疫机制 | 第15页 |
| 1.6 牛支原体病的临床症状及病理变化 | 第15-16页 |
| 1.7 牛支原体病的诊断 | 第16-18页 |
| 1.7.1 病原体的分离鉴定 | 第16页 |
| 1.7.2 血清学诊断 | 第16-17页 |
| 1.7.3 分子生物学诊断 | 第17-18页 |
| 1.8 牛支原体的防治 | 第18页 |
| 1.8.1 牛支原体病的综合防治措施 | 第18页 |
| 1.8.2 牛支原体的治疗 | 第18页 |
| 1.9 牛支原体病疫苗研究进展 | 第18-19页 |
| 1.10 本研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| 2 材料和方法 | 第20-31页 |
| 2.1 材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第20页 |
| 2.1.2 牛支原体菌株及血清 | 第20页 |
| 2.1.3 牛支原体PCR特异性引物 | 第20页 |
| 2.1.4 试验动物 | 第20-21页 |
| 2.1.5 试验溶液及培养基的制备 | 第21页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第21页 |
| 2.2 牛支原体NM2012株vpmaX、GAPDH遗传稳定性研究 | 第21-25页 |
| 2.2.1 引物序列 | 第21页 |
| 2.2.2 牛支原体全基因组DNA的提取 | 第21-22页 |
| 2.2.3 牛支原体vpmaX、GAPDH基因的扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.4 扩增产物的鉴定与目的片段的纯化 | 第23页 |
| 2.2.5 目的片段与pMD-19T克隆载体连接与转化 | 第23-24页 |
| 2.2.6 重组质粒的鉴定 | 第24页 |
| 2.2.7 序列测定与拼接 | 第24-25页 |
| 2.2.8 序列分析 | 第25页 |
| 2.3 牛支原体NM2012株奶牛致病性实验 | 第25-27页 |
| 2.3.1 牛支原体阴性牛的筛选 | 第25页 |
| 2.3.2 攻毒菌的制备 | 第25页 |
| 2.3.3 动物感染实验 | 第25页 |
| 2.3.4 体温检测 | 第25页 |
| 2.3.5 眼部与鼻腔分泌物及咳嗽症状观察 | 第25-26页 |
| 2.3.6 鼻拭子采集和鼻腔排菌检测 | 第26页 |
| 2.3.7 血液免疫学指标检测 | 第26页 |
| 2.3.8 牛支原体的分离 | 第26页 |
| 2.3.9 病理变化观察 | 第26-27页 |
| 2.4 鼠抗牛支原体抗体的间接ELISA检测方法的建立 | 第27-29页 |
| 2.4.1 抗原的制备 | 第27页 |
| 2.4.2 ELISA操作流程 | 第27页 |
| 2.4.3 最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定 | 第27页 |
| 2.4.4 最佳封闭液的确定 | 第27页 |
| 2.4.5 一抗作用时间的优化 | 第27-28页 |
| 2.4.6 酶标抗体浓度的优化 | 第28页 |
| 2.4.7 酶标抗体作用时间的优化 | 第28页 |
| 2.4.8 底物最佳反应量的确定 | 第28页 |
| 2.4.9 底物显色时间的确定 | 第28页 |
| 2.4.10 终止液反应量的确定 | 第28页 |
| 2.4.11 封闭时间的确定 | 第28-29页 |
| 2.4.12 最佳包被条件的确定 | 第29页 |
| 2.4.13 间接ELISA阳性和阴性临界值的确定 | 第29页 |
| 2.4.14 重复性实验 | 第29页 |
| 2.4.15 特异性实验 | 第29页 |
| 2.5 牛支原体NM2012株免疫原性研究 | 第29-31页 |
| 2.5.1 牛支原体灭活菌的制备 | 第29-30页 |
| 2.5.2 疫苗的配制及检测 | 第30页 |
| 2.5.3 疫苗接种 | 第30页 |
| 2.5.4 小鼠血清中抗体水平检测 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-44页 |
| 3.1 牛支原体NM2012株vpmaX、GAPDH遗传稳定性研究 | 第31-33页 |
| 3.1.1 常规PCR扩增结果 | 第31页 |
| 3.1.2 质粒PCR鉴定结果 | 第31-32页 |
| 3.1.3 测序结果 | 第32页 |
| 3.1.4 序列分析结果 | 第32-33页 |
| 3.2 牛支原体NM2012株奶牛致病性实验 | 第33-37页 |
| 3.2.1 体温变化 | 第33-34页 |
| 3.2.2 眼部与鼻腔分泌物及咳嗽症状观察 | 第34页 |
| 3.2.3 鼻腔排菌检测 | 第34-35页 |
| 3.2.4 血液免疫学指标检测 | 第35页 |
| 3.2.5 牛支原体分离培养 | 第35页 |
| 3.2.6 眼观病理变化观察 | 第35-36页 |
| 3.2.7 病理组织学观察 | 第36-37页 |
| 3.3 鼠抗牛支原体抗体的间接ELISA检测方法的建立 | 第37-42页 |
| 3.3.1 最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定结果 | 第37-38页 |
| 3.3.2 最佳封闭液的确定结果 | 第38页 |
| 3.3.3 一抗作用时间的优化结果 | 第38-39页 |
| 3.3.4 酶标抗体稀释浓度的优化结果 | 第39页 |
| 3.3.5 酶标抗体作用时间的优化结果 | 第39页 |
| 3.3.6 最佳底物最佳反应量的确定结果 | 第39-40页 |
| 3.3.7 最佳底物显色时间的确定结果 | 第40页 |
| 3.3.8 最佳终止液反应量的确定结果 | 第40页 |
| 3.3.9 最佳封闭时间的确定结果 | 第40-41页 |
| 3.3.10 最佳包被条件的确定结果 | 第41页 |
| 3.3.11 间接ELISA阳性和阴性临界值的确定结果 | 第41-42页 |
| 3.3.12 重复性试验结果 | 第42页 |
| 3.3.13 特异性试验结果 | 第42页 |
| 3.4 牛支原体NM2012株免疫原性试验结果 | 第42-44页 |
| 3.4.1 牛支原体灭活检验结果 | 第42-43页 |
| 3.4.2 疫苗的检测 | 第43页 |
| 3.4.3 血清抗体检测结果 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-48页 |
| 5 结论 | 第48-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-56页 |
| 作者简介 | 第56页 |
