| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 上篇 文献综述 | 第14-51页 |
| 第一章 芽孢杆菌Rap-Phr系统及其在群体分化中的调控作用 | 第15-29页 |
| 1 芽孢杆菌Rap-Phr系统 | 第16-19页 |
| 1.1 rap-phr基因簇的结构与表达调控 | 第16-17页 |
| 1.2 Rap蛋白的结构特性 | 第17-18页 |
| 1.3 Phr多肽的合成与转运 | 第18-19页 |
| 2 芽孢杆菌的群体分化 | 第19-24页 |
| 2.1 芽孢的分化 | 第21页 |
| 2.2 产基质细胞与产surfactin细胞的分化 | 第21-22页 |
| 2.3 感受态细胞的分化 | 第22-23页 |
| 2.4 吞噬细胞的分化 | 第23页 |
| 2.5 产胞外蛋白酶细胞的分化 | 第23-24页 |
| 3 Rap-Phr系统对芽孢杆菌群体分化的调控 | 第24-29页 |
| 3.1 Rap蛋白抑制SpoOA的磷酸化 | 第24-26页 |
| 3.2 Rap蛋白抑制ComA功能的发挥 | 第26-27页 |
| 3.3 Rap蛋白抑制DegU的功能 | 第27页 |
| 3.4 Phr多肽抑制Rap蛋白与调控蛋白的互作 | 第27-29页 |
| 第二章 非核糖体多肽合成酶的合成机理与产物 | 第29-41页 |
| 1 非核糖体多肽合成酶中的模块与功能域 | 第30-36页 |
| 1.1 腺苷酰化功能域(Adenylation domain,A domain) | 第31-32页 |
| 1.2 肽转运蛋白(Peptidyl Carrier Protein,PCP domain) | 第32-33页 |
| 1.3 缩合功能域(Condensation domain,C domain) | 第33-34页 |
| 1.4 硫酯酶功能域(Thioesterase domain,TE domain) | 第34-35页 |
| 1.5 非核糖体多肽的合成次序 | 第35-36页 |
| 2 NRPSs中不同功能域间的互作 | 第36-38页 |
| 2.1 PCP domain与C domain,TE domain间的互作 | 第37页 |
| 2.2 NRPSs终止模块的结构 | 第37-38页 |
| 3 非核糖体途径合成多肽的多样性 | 第38-39页 |
| 4 问题与展望 | 第39-41页 |
| 第三章 环状双肽的合成机理与生物功能 | 第41-51页 |
| 1 环状双肽合成酶合成机理 | 第41-45页 |
| 1.1 CDPS基因簇的分布与组成 | 第42-43页 |
| 1.2 CDPSs的结构特点 | 第43-44页 |
| 1.3 CDPSs的酶学性状 | 第44-45页 |
| 2 CDPSs产物的人工修饰与改造 | 第45-48页 |
| 2.1 CDPs中氨基酸的置换 | 第45-47页 |
| 2.2 CDPs肽链的修饰 | 第47-48页 |
| 3 环状双肽的生物学功能 | 第48-50页 |
| 3.1 细菌的群体感应现象 | 第48-49页 |
| 3.2 CDPs是可能的群体信号分子 | 第49-50页 |
| 4 问题与展望 | 第50-51页 |
| 下篇 研究内容 | 第51-133页 |
| 第一章 解淀粉芽孢杆菌B3内生质粒中Rap-Phr系统功能研究 | 第53-81页 |
| 1 材料方法 | 第55-69页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第55-56页 |
| 1.2 酶和引物合成 | 第56-57页 |
| 1.3 构建表达rapQ或rapQ-phrQ基因的OKB105菌株 | 第57-62页 |
| 1.4 产芽孢效率检测 | 第62页 |
| 1.5 芽孢杆菌sufctin产量分析 | 第62-63页 |
| 1.6 芽孢杆菌转化效率检测 | 第63页 |
| 1.7 芽孢杆菌SM与Landy培养基生长曲线的制作 | 第63-64页 |
| 1.8 Quantiative RT-PCR (qRT-PCR)检测芽孢形成与surfactin合成相关基因表达量 | 第64-65页 |
| 1.9 蛋白表达菌株的构建 | 第65-66页 |
| 1.10 重组蛋白的表达与纯化 | 第66-68页 |
| 1.11 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)实验检测Rap、comA与srfA启动子的互作 | 第68-69页 |
| 2 结果与分析 | 第69-79页 |
| 2.1 表达rapQ或rapQ-phrQ基因的OKB105菌株的构建 | 第69-70页 |
| 2.2 表型实验结果 | 第70-75页 |
| 2.3 表达水平上分析该Rap-Phr系统调控的表型相关基因的表达情况 | 第75-76页 |
| 2.4 内生质粒的Rap-Phr系统调控机理的研究 | 第76-79页 |
| 3 讨论 | 第79-81页 |
| 第二章 解淀粉芽孢杆菌B3菌株中新NRPSs基因簇的研究 | 第81-103页 |
| 1 材料与方法 | 第83-92页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第83-84页 |
| 1.2 基因组的生物信息学分析 | 第84页 |
| 1.3 酶和引物合成 | 第84-85页 |
| 1.4 蛋白表达菌株的构建 | 第85-87页 |
| 1.5 重组蛋白的表达与纯化 | 第87-88页 |
| 1.6 ATP-PPi exchange筛选A domain底物氨基酸 | 第88页 |
| 1.7 B3菌株次生代谢产物HPLC-MS分析 | 第88-89页 |
| 1.8 TAR捕获载体pCAP01-LR的构建 | 第89-90页 |
| 1.9 酵母作为宿主菌的TAR克隆 | 第90-92页 |
| 2 结果与分析 | 第92-101页 |
| 2.1 B3菌株未知功能非核糖体肽基因簇(non-ribosomal peptide synthetases,NRPSs)生物信息学分析 | 第92-95页 |
| 2.2 ATP-PPi实验结果 | 第95-100页 |
| 2.3 NRPS基因簇表达产物的放射性标记实验 | 第100页 |
| 2.4 使用酵母菌为宿主菌的TAR克隆 | 第100-101页 |
| 3 讨论 | 第101-103页 |
| 第三章 Parachlamydia acanthamoebae环状双脯氨酸合成酶及LuxR调控蛋白的研究 | 第103-133页 |
| 1 材料与方法 | 第105-117页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第105-107页 |
| 1.2 基因的序列分析以及蛋白三维结构预测 | 第107页 |
| 1.3 酶,基因与引物合成 | 第107-109页 |
| 1.4 PaH异源表达菌株的构建以及表达产物的鉴定 | 第109-110页 |
| 1.5 PaH定点突变体的构建及其产物分析 | 第110-111页 |
| 1.6 PaH重组蛋白的表达与纯化 | 第111-112页 |
| 1.7 使用T7 DNA聚合酶体外合成tRNA~(Pro) | 第112-113页 |
| 1.7.1 tRNA~(Pro)的体外合成 | 第112-113页 |
| 1.7.2 tRNA~(Pro)的纯化 | 第113页 |
| 1.8 Prolyl-tRNA合成酶(ProS)重组表达菌株的构建及纯化 | 第113-114页 |
| 1.9 PaH体外活性的检测 | 第114页 |
| 1.10 LuxR重组蛋白表达菌株的构建及其表达纯化 | 第114-115页 |
| 1.11 LuxR蛋白与cPP的体外结合 | 第115-116页 |
| 1.12 LuxR,cPP与paH启动子的体内互作实验 | 第116-117页 |
| 2 结果与分析 | 第117-131页 |
| 2.1 PaH合成产物的鉴定 | 第117-119页 |
| 2.2 PaH活性位点氨基酸的鉴定 | 第119-124页 |
| 2.3 PaH重组蛋白的表达纯化与体外酶活检测 | 第124-126页 |
| 2.4 LuxR家族蛋白的功能分析及其表达菌株的构建 | 第126-127页 |
| 2.5 LuxR重组蛋白的纯化与cPP的体外结合 | 第127-130页 |
| 2.6 LuxR,cPP与paH启动子的体内互作 | 第130-131页 |
| 3 讨论 | 第131-133页 |
| 全文总结与创新点 | 第133-137页 |
| 参考文献 | 第137-163页 |
| 附录 | 第163-167页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第167-169页 |
| 致谢 | 第169页 |
