| 摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-41页 |
| 1.艾滋病和HIV | 第16-24页 |
| ·艾滋病流行情况 | 第16页 |
| ·艾滋病的病原学特点 | 第16-19页 |
| ·HIV颗粒结构 | 第16-17页 |
| ·HIV基因结构、编码蛋白及其功能 | 第17-19页 |
| ·抗艾滋病药物的作用靶点 | 第19-24页 |
| ·HIV-1逆转录酶抑制剂 | 第20-21页 |
| ·蛋白酶抑制剂 | 第21页 |
| ·整合酶抑制剂 | 第21页 |
| ·以宿主细胞CD_4为靶点 | 第21-22页 |
| ·以HIV-1 gp120为靶点 | 第22页 |
| ·阻断HIV-1 gp120与协同受体的结合抑制剂 | 第22-23页 |
| ·阻断HIV-1 gp41与靶细胞膜的融合抑制剂 | 第23-24页 |
| 2 天然免疫分子TRIM5α的研究简介 | 第24-30页 |
| ·TRIM5α蛋白抗HIV-1作用的发现 | 第24-25页 |
| ·TRIM5分子的结构特点 | 第25-26页 |
| ·TRIM5α分子限制HIV-1感染和复制的作用机制 | 第26-28页 |
| ·与TRIM5α同源的蛋白 | 第28-29页 |
| ·讨论 | 第29页 |
| ·研究展望 | 第29-30页 |
| 3.穿膜肽是一种高效低毒的蛋白运载工具 | 第30-36页 |
| ·穿膜肽的发现与研究意义 | 第30-31页 |
| ·PTD的种类 | 第31-32页 |
| ·单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白 | 第31页 |
| ·HIV病毒的Tat蛋白 | 第31页 |
| ·果蝇触角蛋白同源结构域(DrosophilaAntermapediaHomeodomain,AntpHD) | 第31-32页 |
| ·人工设计的PTD | 第32页 |
| ·其他PTD蛋白 | 第32页 |
| ·穿膜肽的跨膜机制 | 第32-36页 |
| ·穿膜肽内在化作用的基本特点 | 第32-33页 |
| ·穿膜肽可能的跨膜机制 | 第33-36页 |
| 参考文献 | 第36-41页 |
| 第二章 人天然免疫基因TRIM5α的克隆、序列及进化分析 | 第41-57页 |
| 1 前言 | 第41页 |
| 2 材料和方法 | 第41-47页 |
| ·材料 | 第41-44页 |
| ·菌株和载体 | 第41页 |
| ·PCR引物序列 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41-42页 |
| ·主要仪器设备 | 第42页 |
| ·主要溶液及缓冲液的配制 | 第42-43页 |
| ·生物信息学分析的主要软件与数据库 | 第43-44页 |
| ·实验方法 | 第44-47页 |
| ·引物合成 | 第44页 |
| ·HeLa细胞总RNA的提取(TRIzol法) | 第44-45页 |
| ·两步法RT-PCR | 第45页 |
| ·TRIM5α/PUC57-T重组质粒的构建及鉴定 | 第45-47页 |
| 3 结果 | 第47-54页 |
| ·细胞总RNA抽提 | 第47页 |
| ·TRIM5α基因的PCR扩增及鉴定 | 第47-48页 |
| ·TRIM5α/pUC57-T重组子的筛选及PCR鉴定 | 第48页 |
| ·测序结果 | 第48页 |
| ·人TRIM5α基因的序列分析 | 第48-54页 |
| ·人TRIM5α基因的染色体定位分析 | 第48-49页 |
| ·TRIM5α蛋白质理化特性 | 第49页 |
| ·TRIM5α信号肽分析 | 第49-50页 |
| ·TRIM5α跨膜预测 | 第50页 |
| ·用DNAMAN进行同源性比较 | 第50-51页 |
| ·TRIM5α序列联配及进化分析 | 第51-53页 |
| ·TRIM5α二级结构预测 | 第53页 |
| ·蛋白质基序分析 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-57页 |
| 第三章 PTD-TRIM5α及PTD-TRIM5αH(R328-332)的构建、表达与纯化复性 | 第57-77页 |
| 1 引言 | 第57-58页 |
| 2 材料和方法 | 第58-69页 |
| ·材料 | 第58-62页 |
| ·克隆载体及克隆菌株 | 第58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58-59页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·主要溶液及试剂配制 | 第59-62页 |
| ·方法 | 第62-69页 |
| ·引物设计 | 第62页 |
| ·PCR反应 | 第62-64页 |
| ·PCR产物的检测与回收 | 第64页 |
| ·PCR产物的TA克隆 | 第64页 |
| ·载体的制备及酶切 | 第64-66页 |
| ·酶切产物的连接及转化 | 第66页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第66页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)在大肠杆菌中的表达与鉴定 | 第66-68页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的镍柱亲和层析 | 第68页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的复性 | 第68-69页 |
| 3 结果与分析 | 第69-73页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)基因的扩增 | 第69-70页 |
| ·重组质粒PTD-TRIM5α/pET28a和PTD-TRIM5αH(R328-332)/pET28a的鉴定 | 第70-71页 |
| ·重组质粒TRIM5α/pEASY和TRIM5αH(R328-332)/pEASY的酶切鉴定 | 第70-71页 |
| ·阳性菌落的PCR鉴定 | 第71页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第71页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)在BL21(DE3)中的表达 | 第71-72页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的Western blot验证 | 第72-73页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的亲和层析 | 第73页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的复性和脱盐浓缩 | 第73页 |
| 4 讨论 | 第73-76页 |
| 参考文献 | 第76-77页 |
| 第四章 人TRIM5α及其嵌合体蛋白与HIV-1Gag蛋白体外分子间相互作用的鉴定 | 第77-84页 |
| 1 前言 | 第77页 |
| 2 材料和方法 | 第77-80页 |
| ·材料 | 第77-79页 |
| ·试剂 | 第77-78页 |
| ·溶液配制 | 第78-79页 |
| ·方法 | 第79-80页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白的免疫共沉淀 | 第79页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白的His pull down | 第79页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白相互作用的ELISA鉴定 | 第79-80页 |
| 3 结果 | 第80-81页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白的免疫共沉淀 | 第80页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白(CN-54,55kD)的His pull down | 第80-81页 |
| ·TRIM5α/TRIM5αH(R328-332)蛋白与HIV-1Gag蛋白相互作用的ELISA鉴定 | 第81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-84页 |
| 第五章 PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的体外抑制HIV-1的研究 | 第84-100页 |
| 1 引言 | 第84页 |
| 2 材料与方法 | 第84-90页 |
| ·材料 | 第84-86页 |
| ·细胞和病毒 | 第84-85页 |
| ·主要设备 | 第85页 |
| ·主要试剂 | 第85页 |
| ·主要溶液 | 第85-86页 |
| ·方法 | 第86-90页 |
| ·重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的穿膜研究 | 第86-87页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的细胞毒性研究 | 第87页 |
| ·HIV-1与Molt4细胞的共培养 | 第87-88页 |
| ·药物对HIV-1_(ⅢB)诱导的细胞合胞体形成抑制实验 | 第88-89页 |
| ·药物对HIV-1的抑制作用实验 | 第89-90页 |
| 3 结果与分析 | 第90-95页 |
| ·浓度和时间对重组蛋白穿膜效率的影响 | 第90页 |
| ·重组蛋白PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)对Molt4的穿膜效率 | 第90-91页 |
| ·药物在体外对Molt4细胞的毒性作用 | 第91-93页 |
| ·药物对HIV-1_(ⅢB)诱导的细胞合胞体形成抑制作用 | 第93-94页 |
| ·药物对培养上清中p24抗原水平的影响 | 第94-95页 |
| 4 讨论 | 第95-99页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的穿膜及靶向性 | 第95-96页 |
| ·PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)的细胞毒性和对细胞增殖的影响 | 第96页 |
| ·重组蛋白对HIV-1的抑制作用作用 | 第96-99页 |
| 参考文献 | 第99-100页 |
| 结论、创新性与展望 | 第100-102页 |
| 结论 | 第100页 |
| 创新性 | 第100页 |
| 问题与展望 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 附录 | 第103-111页 |
| A.攻读博士学位期间论文发表及科研成果情况 | 第103页 |
| B.攻读博士学位期间参加科研项目 | 第103-104页 |
| 缩略语表 | 第104-106页 |
| 附录图 1 TRIM5α的测序结果(正向) | 第106-107页 |
| 附录图 1 TRIM5α的测序结果(反向) | 第107-108页 |
| 附录图 2 PTD-TRIM5αH(R328-332)的测序结果(正向) | 第108-109页 |
| 附录图 2 PTD-TRIM5αH(R328-332)的测序结果(反向) | 第109-110页 |
| 附录图 3 PTD-TRIM5α的测序结果(正向) | 第110-111页 |
| 附录图 3 PTD-TRIM5α的测序结果(反向) | 第111页 |
