| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-15页 |
| 1 绪论 | 第15-38页 |
| ·引言 | 第15-16页 |
| ·昆虫病原真菌的侵染过程 | 第16-17页 |
| ·绿僵菌的侵染机理研究进展 | 第17-26页 |
| ·绿僵菌对寄主的识别与粘附 | 第18-19页 |
| ·绿僵菌侵染寄主过程中附着胞形成 | 第19-21页 |
| ·绿僵菌对寄主体壁的穿透机制 | 第21-24页 |
| ·绿僵菌进入寄主血淋巴后的适应机制 | 第24-26页 |
| ·寄主对昆虫病原真菌的防御 | 第26-29页 |
| ·寄主表皮对昆虫病原真菌的阻抑作用 | 第26-27页 |
| ·昆虫的先天免疫系统对昆虫病原真菌的识别与防御 | 第27-29页 |
| ·抑制性消减杂交技术（SSH） | 第29-32页 |
| ·SSH 的原理及应用 | 第29-30页 |
| ·SSH 技术评价 | 第30-32页 |
| ·均一化技术 | 第32-33页 |
| ·常用的均一化技术 | 第32页 |
| ·基于DSN 的均一化技术 | 第32-33页 |
| ·立题依据 | 第33-35页 |
| ·研究内容和技术路线 | 第35-37页 |
| ·研究内容 | 第35-36页 |
| ·技术路线 | 第36-37页 |
| ·本研究的创新点 | 第37-38页 |
| 2 快速从感病寄主血淋巴中分离病原物菌体方法的建立 | 第38-48页 |
| ·引言 | 第38页 |
| ·材料与方法 | 第38-44页 |
| ·实验菌株及培养基 | 第38-39页 |
| ·主要仪器设备 | 第39页 |
| ·主要溶液及配制 | 第39-40页 |
| ·东亚飞蝗总RNA 的提取 | 第40-41页 |
| ·绿僵菌总RNA 的提取 | 第41页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴的收集 | 第41-42页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴中绿僵菌菌丝体的快速分离 | 第42页 |
| ·寄主血淋巴中分离菌丝体mRNA 的提取 | 第42-43页 |
| ·寄主特异检测引物设计和反转录体系构建 | 第43-44页 |
| ·结果与分析 | 第44-45页 |
| ·细胞裂解液对寄主血淋巴中虫菌体的影响 | 第44-45页 |
| ·cDNA 中寄主核酸的检测 | 第45页 |
| ·讨论 | 第45-48页 |
| ·寄主血淋巴中菌体分离技术的设计 | 第45-46页 |
| ·寄主核酸的降解 | 第46-48页 |
| 3 利用抑制性消减杂交技术筛选绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因 | 第48-78页 |
| ·引言 | 第48-49页 |
| ·筛选定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因的目的与意义 | 第48-49页 |
| ·克隆定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因方法选择 | 第49页 |
| ·材料与方法 | 第49-63页 |
| ·供试菌株 | 第49-50页 |
| ·主要仪器设备 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·培养基及部分储液配方 | 第50-51页 |
| ·供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备 | 第51页 |
| ·绿僵菌油剂悬浮液接种东亚飞蝗 | 第51页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴收集 | 第51-52页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴中病原物菌体的分离 | 第52页 |
| ·寄主血淋巴中分离病原物菌体mRNA 的提取 | 第52-53页 |
| ·寄主血淋巴混合总RNA 的提取 | 第53页 |
| ·绿僵菌在附着胞形成时期菌体的获得 | 第53页 |
| ·绿僵菌在附着胞形成时期总RNA 的提取 | 第53-54页 |
| ·cDNA 的合成 | 第54-55页 |
| ·Rsa I 酶切 | 第55页 |
| ·接头连接和连接效率检测 | 第55-57页 |
| ·两次差减杂交 | 第57页 |
| ·两次PCR 扩增 | 第57-58页 |
| ·差减产物的克隆和检测 | 第58-59页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第59-60页 |
| ·阳性克隆的测序和EST 序列分析 | 第60-61页 |
| ·感受态细胞的制备和电转化 | 第61-62页 |
| ·半定量RT-PCR 分析特异表达基因在侵染不同时期的表达水平 | 第62-63页 |
| ·结果和分析 | 第63-74页 |
| ·绿僵菌穿透表皮，进入寄主血淋巴后不同时期的状态 | 第63-64页 |
| ·mRNA 质量检测和cDNA 合成 | 第64-65页 |
| ·酶切效率检测 | 第65-66页 |
| ·连接效率检测 | 第66页 |
| ·消减杂交 PCR 产物分析 | 第66-67页 |
| ·消减效率检测 | 第67-68页 |
| ·插入片断大小检测 | 第68页 |
| ·消减文库的筛选 | 第68-69页 |
| ·测序结果和分析 | 第69-73页 |
| ·特异表达基因在致病不同阶段的表达变化 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-78页 |
| ·抑制消减杂交中tester 和driver 的选择 | 第74页 |
| ·特异表达基因的功能分析与预测 | 第74-78页 |
| 4 利用抑制性消减杂交技术筛选绿僵菌附着孢形成时期特异表达基因 | 第78-96页 |
| ·引言 | 第78-79页 |
| ·材料与方法 | 第79-84页 |
| ·供试菌株 | 第79-80页 |
| ·主要仪器设备 | 第80页 |
| ·主要试剂 | 第80页 |
| ·培养基及部分储液配方 | 第80-81页 |
| ·菌株培养、分生孢子悬浮液的制备和接种 | 第81页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴收集，菌丝体分离，m RNA 提取 | 第81页 |
| ·绿僵菌在附着胞形成时期菌丝体的获得 | 第81页 |
| ·绿僵菌在附着胞形成时期总RNA 的提取 | 第81页 |
| ·消减杂交 | 第81-82页 |
| ·半定量RT-PCR 验证SSH 结果 | 第82-84页 |
| ·结果和分析 | 第84-93页 |
| ·试验材料的准备 | 第84页 |
| ·连接效率检测 | 第84-85页 |
| ·消减效率检测 | 第85-86页 |
| ·消减杂交 PCR 产物分析 | 第86页 |
| ·插入片断大小检测 | 第86页 |
| ·消减文库的筛选 | 第86-87页 |
| ·测序结果和分析 | 第87-91页 |
| ·RT-PCR 验证结果 | 第91-93页 |
| ·讨论 | 第93-96页 |
| 5 绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段全长均一化文库的构建 | 第96-121页 |
| ·引言 | 第96-99页 |
| ·研究目的与意义 | 第96-97页 |
| ·均一化cDNA 文库构建技术的选择 | 第97页 |
| ·EST序列分析 | 第97-99页 |
| ·材料与方法 | 第99-107页 |
| ·供试菌株和载体 | 第99页 |
| ·培养基和部分储存液的配制 | 第99页 |
| ·主要仪器 | 第99-100页 |
| ·主要试剂 | 第100页 |
| ·供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备 | 第100页 |
| ·绿僵菌接种和染病东亚飞蝗血淋巴的收集 | 第100-101页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴中病原物菌体的分离 | 第101页 |
| ·寄主血淋巴中分离病原物菌体的mRNA 提取 | 第101页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第101页 |
| ·cDNA 第二链的合成 | 第101-102页 |
| ·全长cDNA 的均一化 | 第102页 |
| ·均一化效果检测 | 第102-103页 |
| ·cDNA 片段的酶切和分级分离 | 第103页 |
| ·cDNA 与载体pDNR-lib 连接 | 第103-104页 |
| ·转化 | 第104页 |
| ·文库质量的鉴定 | 第104-105页 |
| ·序列测定与EST 序列分析 | 第105-106页 |
| ·pDNR-LIB 载体制备 | 第106-107页 |
| ·结果和分析 | 第107-114页 |
| ·mRNA 的分离 | 第107-108页 |
| ·全长cDNA 的合成 | 第108页 |
| ·均一化效果检测 | 第108-110页 |
| ·文库滴度和插入片断大小分析 | 第110-111页 |
| ·测序结果分析 | 第111-114页 |
| ·讨论 | 第114-121页 |
| 6 绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段全长 cDNA 文库的构建 | 第121-131页 |
| ·引言 | 第121页 |
| ·材料与方法 | 第121-124页 |
| ·供试菌株和载体 | 第121页 |
| ·培养基和部分储存液的配制 | 第121-122页 |
| ·主要仪器 | 第122页 |
| ·主要试剂 | 第122-123页 |
| ·供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备 | 第123页 |
| ·东亚飞蝗血淋巴中无寄主核酸污染的菌丝体的获得 | 第123页 |
| ·寄主血淋巴来源的mRNA 的获得 | 第123页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第123页 |
| ·cDNA 文库构建 | 第123页 |
| ·序列测定与EST 序列分析 | 第123-124页 |
| ·结果与分析 | 第124-126页 |
| ·mRNA 的分离 | 第124页 |
| ·全长cDNA 的合成 | 第124页 |
| ·文库滴度和插入片段分析 | 第124-125页 |
| ·EST 序列分析与功能聚类 | 第125-126页 |
| ·讨论 | 第126-131页 |
| 7 主要结论及后续工作建议 | 第131-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 参考文献 | 第134-147页 |
| 附录 | 第147-148页 |
| A. 攻读博士期间论文发表情况 | 第147页 |
| B. 抑制消减杂交接头序列 | 第147-148页 |
| C. cDNA 文库构建中，载体 pDNR-lib 结构和酶切位点 | 第148页 |
