| 中文摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-6页 |
| 缩略词表 | 第6-13页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的和意义 | 第13-21页 |
| 第一章 疱疹病毒UL26.5基因及其编码蛋白研究进展 | 第13-21页 |
| 1. 鸭瘟病毒概述 | 第13-14页 |
| ·鸭瘟病毒形态 | 第13页 |
| ·鸭瘟病毒形态发生 | 第13-14页 |
| ·鸭瘟病毒基因的研究现状 | 第14页 |
| 2. 疱疹病毒 UL26.5基因及其编码蛋白的研究进展 | 第14-20页 |
| ·疱疹病毒分类 | 第14页 |
| ·疱疹病毒衣壳的结构和组成 | 第14-15页 |
| ·疱疹病毒UL26.5基因序列及其编码蛋白的特点 | 第15页 |
| ·UL26.5基因序列的特点 | 第15页 |
| ·UL26.5氨基酸序列的特点 | 第15页 |
| ·UL26.5蛋白的作用 | 第15-18页 |
| ·UL26.5蛋白对病毒生长影响 | 第15-16页 |
| ·UL26.5蛋白自身的联结 | 第16页 |
| ·UL26.5蛋白的细胞定位 | 第16-17页 |
| ·UL26.5蛋白的核定位 | 第17页 |
| ·UL26.5蛋白参与衣壳装配 | 第17-18页 |
| ·UL26.5蛋白的磷酸化 | 第18页 |
| ·UL26.5蛋白与其它蛋白的相互作用 | 第18-20页 |
| ·UL26.5蛋白与 UL19蛋白的连接 | 第18-19页 |
| ·UL26.5蛋白与 UL6蛋白的连接 | 第19-20页 |
| ·展望 | 第20页 |
| 3. 选题目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二部分 试验研究 | 第21-67页 |
| 第二章 序列分析 | 第21-31页 |
| 1. DPV UL26.5基因与其它疱疹病毒 UL26.5基因参考序列 | 第21页 |
| 2. 生物信息学分析工具 | 第21页 |
| 3. 方法 | 第21-23页 |
| ·UL26.5基因的获得 | 第21页 |
| ·斑点杂交试验对 UL26.5基因的验证 | 第21-23页 |
| ·UL26.5基因探针的制备 | 第21-22页 |
| ·杂交检测程序 | 第22-23页 |
| ·核酸探针特异性检测 | 第23页 |
| ·UL26.5基因的序列分析 | 第23页 |
| 4. 结果 | 第23-29页 |
| ·DNA斑点杂交检测 DPV UL26.5基因 | 第23页 |
| ·UL26.5基因的生物信息学分析 | 第23-29页 |
| ·UL26.5基因的序列 | 第23-25页 |
| ·疏水性分析 | 第25页 |
| ·信号肽分析 | 第25-26页 |
| ·跨膜区预测结果 | 第26页 |
| ·二级结构预测分析 | 第26-27页 |
| ·功能位点分析 | 第27页 |
| ·UL26.5氨基酸序列同源性分析 | 第27-28页 |
| ·UL26.5基因进化树的构建 | 第28-29页 |
| 5. 讨论 | 第29-31页 |
| 第三章 鸭瘟病毒 UL26.5基因克隆、表达及多克隆抗体的制备 | 第31-51页 |
| 1. 材料 | 第31-34页 |
| ·菌株/载体 | 第31页 |
| ·实验动物 | 第31页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第31页 |
| ·主要溶液的配制 | 第31-33页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞相关溶液 | 第31-32页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第32页 |
| ·质粒提取相关溶液 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE电泳相关溶液 | 第32-33页 |
| ·培养细菌所用溶液 | 第33页 |
| ·His标签重组蛋白纯化试剂 | 第33页 |
| ·弗氏佐剂 | 第33页 |
| ·免疫印迹相关试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器设备 | 第33-34页 |
| ·其它 | 第34页 |
| 2. 试验方法 | 第34-42页 |
| ·DPV基因组 DNA提取 | 第34页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞(DEF) | 第34页 |
| ·DPV接种鸭胚成纤维单层细胞 | 第34页 |
| ·DPV DNA提取 | 第34页 |
| ·PCR扩增鸭瘟病毒 UL26.5基因 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·UL26.5基因的PCR扩增 | 第35页 |
| ·UL26.5基因的 T-载体克隆与鉴定 | 第35-37页 |
| ·UL26.5基因的T-载体克隆 | 第35页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第35-37页 |
| ·UL26.5基因重组表达菌株的构建 | 第37-38页 |
| ·pMD18-UL26.5及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收 | 第37-38页 |
| ·酶切回收产物pET-32a(+)与 UL26.5片段的连接 | 第38页 |
| ·重组表达质粒转化感受态细胞 DH5α | 第38页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第38页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第38页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化 | 第38-40页 |
| ·重组表达菌株的培养及表达 | 第38-39页 |
| ·重组表达质粒 SDS-PAGE电泳检测 | 第39页 |
| ·重组质粒表达条件的优化 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第40页 |
| ·样品制备(可溶性蛋白) | 第40页 |
| ·镍 NTA琼脂糖凝胶 FF过柱纯化重组蛋白 | 第40页 |
| ·兔高免血清的制备 | 第40-42页 |
| ·免疫原的制备 | 第40-41页 |
| ·兔抗 DPV UL26.5高免血清的制备 | 第41页 |
| ·Western-blotting检测 | 第41页 |
| ·琼脂扩散试验检测兔抗 UL26.5抗体效价 | 第41-42页 |
| ·兔抗 DPV UL26.5高免血清 IgG的纯化及鉴定 | 第42页 |
| ·正辛酸—硫酸铵粗提取兔抗 DPV UL26.5 IgG | 第42页 |
| ·兔抗 DPV UL26.5 IgG的纯化 | 第42页 |
| ·纯化IgG的纯度测定 | 第42页 |
| 3. 结果 | 第42-49页 |
| ·鸭瘟病毒 UL26.5基因的扩增、克隆与鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组表达质粒pET-32a-UL26.5的构建及鉴定 | 第43-44页 |
| ·表达质粒的重组与转化 | 第43页 |
| ·重组表达质粒pET-32a-UL26.5的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的诱导表达及表达条件优化 | 第44-46页 |
| ·重组质粒的小量诱导表达 | 第44页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第44-45页 |
| ·诱导时间的优化 | 第45-46页 |
| ·诱导温度的优化 | 第46页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| ·镍 NTA琼脂糖凝胶 FF过柱纯化 | 第46-47页 |
| ·过柱纯化样品 SDS-PAGE电泳 | 第47页 |
| ·Western-blotting检测 | 第47-48页 |
| ·兔抗 UL26.5血清琼脂扩散试验效价的检测 | 第48页 |
| ·兔抗 DPV UL26.5 IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定 | 第48-49页 |
| 4. 讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 荧光定量 PCR检测鸭瘟病毒体外感染宿主细胞 UL26.5 mRNA的表达 | 第51-60页 |
| 1. 材料 | 第51-52页 |
| ·毒株/细胞 | 第51页 |
| ·主要试剂及配制 | 第51-52页 |
| ·主要试剂 | 第51页 |
| ·细胞培养溶液 | 第51-52页 |
| ·主要仪器设备 | 第52页 |
| ·其它 | 第52页 |
| 2. 实验方法 | 第52-55页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒感染 | 第52-53页 |
| ·RNA提取 | 第53页 |
| ·总 RNA进行逆转录 | 第53页 |
| ·引物设计和合成 | 第53页 |
| ·引物特异性检测 | 第53-54页 |
| ·β-actin的特异性检测 | 第53-54页 |
| ·UL26.5基因的特异性检测 | 第54页 |
| ·制备标准品 | 第54页 |
| ·实时荧光定量 PCR标准曲线的制作 | 第54页 |
| ·实时荧光定量 PCR反应 | 第54页 |
| ·实时荧光定量 PCR结果分析 | 第54-55页 |
| 3. 结果 | 第55-58页 |
| ·引物特异性检测 | 第55页 |
| ·标准曲线的制作 | 第55-56页 |
| ·DEF感染 DPV后 UL26.5基因的转录变化 | 第56-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-60页 |
| 第五章 鸭瘟病毒体外感染鸭胚成纤维细胞中UL26.5基因的表达与定位 | 第60-67页 |
| 1. 材料 | 第60页 |
| ·毒株/细胞 | 第60页 |
| ·主要试剂及配制 | 第60页 |
| ·主要仪器设备 | 第60页 |
| 2. 实验方法 | 第60-61页 |
| ·间接免疫荧光检测 DPV UL26.5在鸭胚成纤维细胞定位的方法 | 第60-61页 |
| ·间接免疫荧光检测 DPV UL26.5基因产物细胞定位的方法 | 第60-61页 |
| ·特异性检测 | 第61页 |
| ·结果判定标准 | 第61页 |
| ·DPV UL26.5基因产物在细胞中定位的动态监测 | 第61页 |
| 3. 结果 | 第61-65页 |
| ·间接免疫荧光检测 DPV UL26.5细胞定位条件的确定 | 第61-62页 |
| ·特异性试验 | 第62页 |
| ·DPV UL26.5基因产物在细胞定位的动态监测 | 第62-65页 |
| 4. 讨论 | 第65-67页 |
| 第三部分 结论 | 第67-68页 |
| 第四部分 参考文献 | 第68-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 作者简介 | 第76页 |
