| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 引言 | 第8-22页 |
| 1.1 丝状真菌概述 | 第8-12页 |
| 1.1.1 黑曲霉简介 | 第9页 |
| 1.1.2 黑曲霉遗传改造技术发展及现状 | 第9-11页 |
| 1.1.2.1 原生质体介导转化法(PEG-mediated transformation,PMT) | 第10页 |
| 1.1.2.2 电击介导转化法(Electrotransformation,ET) | 第10页 |
| 1.1.2.3 根瘤农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation,ATMT) | 第10-11页 |
| 1.1.2.4 生物弹道转化法(Biolistic Transformation,BT) | 第11页 |
| 1.1.3 黑曲霉转化系统的筛选标签 | 第11-12页 |
| 1.1.3.1 药物抗性选择标签 | 第11页 |
| 1.1.3.2 营养缺陷型选择标签 | 第11-12页 |
| 1.1.3.3 报告基因 | 第12页 |
| 1.1.4 自主复制型质粒(Autonomously Replicating Plasmid,ARP) | 第12页 |
| 1.2 基因组编辑技术概述 | 第12-20页 |
| 1.2.1 ZFNs | 第13-14页 |
| 1.2.2 TALENs | 第14-18页 |
| 1.2.2.1 TALENs的特异性识别与切割 | 第14-16页 |
| 1.2.2.2 TALENs靶标位点选择及组装策略 | 第16-17页 |
| 1.2.2.3 Golden Gate法组装TALENs | 第17页 |
| 1.2.2.4 TALENs的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.3 CRISPR | 第18-20页 |
| 1.3 选题依据与研究内容 | 第20-22页 |
| 1.3.1 选题依据 | 第20-21页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 GlaA -TALENs的设计和构建 | 第22-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要培养基和溶液 | 第22-24页 |
| 2.1.4 实验所用引物 | 第24页 |
| 2.1.5 仪器和设备 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.2.1 TALENs质粒的提取 | 第25页 |
| 2.2.2 10β感受态细胞的制备及外源DNA的转化 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 E.coli 10β菌株感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.2.2 感受态细胞的转化 | 第26页 |
| 2.2.3 GlaA -TALENs的设计 | 第26-28页 |
| 2.2.4 TALENs左右臂中间载体的构建和验证 | 第28-29页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第29-33页 |
| 2.3.1 GlaA -TALENs模块质粒构建及验证 | 第29-31页 |
| 2.3.2 GlaA -TALENs中间载体构建及验证 | 第31-33页 |
| 2.4 本章小结 | 第33-34页 |
| 第三章 A.niger原生质体介导转化体系的构建 | 第34-43页 |
| 3.1 实验材料 | 第34-35页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第34页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第34页 |
| 3.1.3 主要培养基和溶液 | 第34-35页 |
| 3.1.4 仪器和设备 | 第35页 |
| 3.2 实验方法 | 第35-39页 |
| 3.2.1 酶切产物纯化 | 第35-36页 |
| 3.2.2 割胶回收产物纯化 | 第36页 |
| 3.2.3 重组表达载体pBC-AMA的构建 | 第36-39页 |
| 3.2.3.1 pBC质粒载体线性化 | 第36-37页 |
| 3.2.3.2 线性化载体linear-pBC去磷酸化 | 第37页 |
| 3.2.3.3 AMA1自主复制元件的获得 | 第37页 |
| 3.2.3.4 pBC-AMA重组质粒酶连 | 第37-39页 |
| 3.2.4 A.niger原生质体制备与转化 | 第39页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第39-41页 |
| 3.3.1 潮霉素B对A.niger生长最小抑制浓度 | 第39-40页 |
| 3.3.2 A.niger原生质体制备与转化 | 第40-41页 |
| 3.3.2.1 原生质体释放形态 | 第40页 |
| 3.3.2.2 原生质体转化 | 第40-41页 |
| 3.4 本章小结 | 第41-43页 |
| 第四章 A.niger电击介导转化体系的构建 | 第43-48页 |
| 4.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第43页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.3 主要培养基和溶液 | 第43-44页 |
| 4.1.4 仪器和设备 | 第44页 |
| 4.1.5 引物 | 第44页 |
| 4.2 实验方法 | 第44-45页 |
| 4.2.1 重组质粒pANEp8-hygro的构建 | 第44页 |
| 4.2.2 A.niger电击转化外源核酸 | 第44-45页 |
| 4.2.2.1 A.niger CBS 513.88菌株电击孢子液制备 | 第44-45页 |
| 4.2.2.2 电击转化外源核酸至A.niger CBS 513.88 | 第45页 |
| 4.2.3 电击转化子阳性克隆验证 | 第45页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第45-47页 |
| 4.3.1 电转重组质粒pANEp8-hygro | 第45-47页 |
| 4.4 本章小结 | 第47-48页 |
| 第五章 A.niger根瘤农杆菌介导共转化体系的构建 | 第48-56页 |
| 5.1 实验材料 | 第48-50页 |
| 5.1.1 菌株和质粒 | 第48页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第48页 |
| 5.1.3 主要培养基和溶液 | 第48-49页 |
| 5.1.4 仪器和设备 | 第49页 |
| 5.1.5 引物 | 第49-50页 |
| 5.2 实验方法 | 第50-53页 |
| 5.2.1 农杆菌感受态的制备 | 第50页 |
| 5.2.2 冻融转化法 | 第50页 |
| 5.2.3 农杆菌制备 | 第50页 |
| 5.2.4 A.niger和农杆菌的共转化 | 第50-51页 |
| 5.2.5 筛选转化子 | 第51页 |
| 5.2.6 重组双元载体的构建 | 第51-53页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第53-55页 |
| 5.3.1 A.niger的G418抗性实验 | 第53-54页 |
| 5.3.2 农杆菌介导转化pCAMBIA1302-1R | 第54-55页 |
| 5.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 结论与展望 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附录 | 第66-74页 |
| 个人简历、在学期间的研究成果及发表的学术论文 | 第74页 |
