| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-34页 |
| 1.1 三七研究概况 | 第17-18页 |
| 1.1.1 三七皂苷的生物合成 | 第17-18页 |
| 1.2 有关植物次生代谢的转录因子研究 | 第18-20页 |
| 1.3 植物转录因子的研究 | 第20-23页 |
| 1.3.1 植物转录因子的结构和功能 | 第20-21页 |
| 1.3.1.1 DNA结合区 | 第20页 |
| 1.3.1.2 转录调控区 | 第20-21页 |
| 1.3.1.3 核定位信号 | 第21页 |
| 1.3.1.4 寡聚化位点 | 第21页 |
| 1.3.2 转录因子的活性 | 第21-22页 |
| 1.3.3 植物中次生代谢转录因子的分离和鉴定 | 第22-23页 |
| 1.3.3.1 转录因子的分离 | 第22页 |
| 1.3.3.2 转录因子的功能分析 | 第22-23页 |
| 1.4 植物中与萜类物质次生代谢相关的转录因子研究 | 第23-34页 |
| 1.4.1 AP2/ERF类转录因子 | 第24-26页 |
| 1.4.2 WRKY类转录因子 | 第26-29页 |
| 1.4.3 bHLH类转录因子 | 第29页 |
| 1.4.4 bZIP类转录因子 | 第29-30页 |
| 1.4.5 锌指类转录因子 | 第30页 |
| 1.4.6 其它转录因子 | 第30页 |
| 1.4.7 转录因子在萜类次级代谢物合成方面的应用前景 | 第30-31页 |
| 1.4.8 本课题的研究目的和意义 | 第31-33页 |
| 1.4.9 技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 酵母单杂交方法筛选三七中与茉莉酸甲酯诱导相关的转录因子 | 第34-69页 |
| 前言 | 第34-35页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第35-37页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.1.2 菌株和载体 | 第35页 |
| 2.1.3 试剂 | 第35-37页 |
| 2.1.3.1 试剂盒 | 第35页 |
| 2.1.3.2 酶 | 第35-36页 |
| 2.1.3.3 引物 | 第36-37页 |
| 2.1.4 试剂和培养基 | 第37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-53页 |
| 2.2.1 悬浮细胞总RNA的抽提 | 第37-38页 |
| 2.2.2 RT-PCR确定关键酶基因的表达水平 | 第38-39页 |
| 2.2.3 pBait-AbAi质粒的构建与克隆 | 第39-41页 |
| 2.2.4 通过同源法将诱饵序列导入到Y1HGold | 第41-43页 |
| 2.2.5 通过AbAr表达来检测诱饵菌株 | 第43-44页 |
| 2.2.6 cDNA文库的构建 | 第44-47页 |
| 2.2.6.1 三七悬浮细胞系总RNA的抽提 | 第44页 |
| 2.2.6.2 三七细胞mRNA纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.6.3 cDNA第一链的合成 | 第45-46页 |
| 2.2.6.4 LD-PCR合成双链cDNA | 第46页 |
| 2.2.6.5 ds cDNA双链的纯化 | 第46-47页 |
| 2.2.7 三七细胞cDNA双链的均一化 | 第47-49页 |
| 2.2.7.1 DSN酶处理 | 第47页 |
| 2.2.7.2 cDNA双链合成 | 第47-48页 |
| 2.2.7.3 ds cDNA纯化 | 第48-49页 |
| 2.2.8 酵母单杂交文库的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.8.1 制备酵母感受态细胞 | 第49页 |
| 2.2.8.2 ds cDNA文库、线性表达载体共转含诱饵质粒酵母 | 第49-50页 |
| 2.2.9 酵母单杂交文库的筛选 | 第50页 |
| 2.2.9.1 酵母单杂交文库的一次筛选 | 第50页 |
| 2.2.9.2 阳性克隆的二次筛选 | 第50页 |
| 2.2.10 测序 | 第50页 |
| 2.2.11 筛选片段全长获得 | 第50-52页 |
| 2.2.11.1 5'(3')RACE cDNA文库的构建 | 第50-52页 |
| 2.2.11.2 3'-RACE方法 | 第52页 |
| 2.2.11.3 5'-RACE方法 | 第52页 |
| 2.2.12 DNA片段的回收、连接、转化 | 第52页 |
| 2.2.12.1 片段回收 | 第52页 |
| 2.2.12.2 片段连接 | 第52页 |
| 2.2.12.3 载体转化 | 第52页 |
| 2.2.13 序列分析 | 第52-53页 |
| 2.3 结果和讨论 | 第53-66页 |
| 2.3.1 建库诱导时间的确定 | 第53页 |
| 2.3.2 pAbAi-JERE质粒的构建与克隆 | 第53-54页 |
| 2.3.3 诱饵菌株检测AbA的最适使用浓度 | 第54-55页 |
| 2.3.4 三七细胞均一化cDNA文库的构建 | 第55-58页 |
| 2.3.4.1 三七细胞总RNA提取和mRNA分离 | 第55-56页 |
| 2.3.4.2 ds cDNA的合成 | 第56-57页 |
| 2.3.4.3 ds cDNA的均一化 | 第57页 |
| 2.3.4.4 均一化文库的纯化 | 第57-58页 |
| 2.3.5 三七细胞酵母文库的构建与筛选 | 第58-60页 |
| 2.3.5.1 酵母单杂交文库的构建 | 第58-59页 |
| 2.3.5.2 筛选获得的转录因子片段 | 第59-60页 |
| 2.3.6 三七中转录因子基因全长cDNA的获得及分析 | 第60-66页 |
| 2.3.6.1 PnWRKY1和PnbHLH1全长cDNA的获得 | 第60页 |
| 2.3.6.2 PnWRKY1和PnbHLH1编码蛋白的性质分析 | 第60-63页 |
| 2.3.6.3 PnWRKY1和PnbHLH1序列比对和进化树分析 | 第63-65页 |
| 2.3.6.4 PnWRKY1和PnbHLH1三维结构及功能域的预测和分析 | 第65-66页 |
| 2.4 小结 | 第66-69页 |
| 第三章 PnWRKY1转录因子的功能分析 | 第69-82页 |
| 前言 | 第69页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第69-72页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第69页 |
| 3.1.2 菌株和载体 | 第69页 |
| 3.1.3 试剂 | 第69-72页 |
| 3.1.3.1 试剂盒 | 第69-70页 |
| 3.1.3.2 酶和购买的试剂 | 第70页 |
| 3.1.3.3 引物 | 第70页 |
| 3.1.3.4 外源蛋白诱导、提取、纯化和浓缩所需溶液 | 第70-71页 |
| 3.1.3.5 SDS-PAGE蛋白检测所用试剂 | 第71-72页 |
| 3.1.3.6 EMSA检测所用试剂 | 第72页 |
| 3.2 方法 | 第72-77页 |
| 3.2.1 His-PnWRKY1融合蛋白的诱导表达和纯化 | 第72-75页 |
| 3.2.1.1 融合蛋白的诱导 | 第72-73页 |
| 3.2.1.2 外源蛋白的提取和纯化 | 第73-74页 |
| 3.2.1.3 外源蛋白的浓缩 | 第74-75页 |
| 3.2.2 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第75-77页 |
| 3.2.2.1 探针制备 | 第75页 |
| 3.2.2.2 蛋白与标记探针的结合反应 | 第75-76页 |
| 3.2.2.3 制胶和上样 | 第76页 |
| 3.2.2.4 转膜和紫外交联 | 第76页 |
| 3.2.2.5 结合反应检测 | 第76-77页 |
| 3.3 结果和分析 | 第77-81页 |
| 3.3.1 PnWRKY1基因的原核表达和蛋白纯化 | 第77-80页 |
| 3.3.1.1 原核表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 3.3.1.2 目的蛋白PnWRKY1的诱导表达 | 第78-79页 |
| 3.3.1.3 重组蛋白的提取和纯化 | 第79-80页 |
| 3.3.2 PnWRKY1与顺式作用元件的凝胶阻滞结果 | 第80-81页 |
| 3.4 小结 | 第81-82页 |
| 第四章 总结和展望 | 第82-84页 |
| 4.1 研究总结 | 第82-83页 |
| 4.2 展望 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-94页 |
| 附录A 载体图谱 | 第94-96页 |
| 附录B 攻读硕士期间发表论文目录 | 第96页 |
