| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一篇 着丝粒蛋白CENP-LN识别CENP-A核小体的结构和功能研究 | 第14-130页 |
| 第一章 综述 | 第14-42页 |
| 1.1 有丝分裂 | 第14-16页 |
| 1.1.1 间期(Interphase) | 第14-15页 |
| 1.1.2 分裂期(Mitosis) | 第15-16页 |
| 1.2 着丝粒(Centromere) | 第16-19页 |
| 1.2.1 着丝粒的分类及功能 | 第17-18页 |
| 1.2.2 着丝粒染色质DNA | 第18-19页 |
| 1.3 动粒(Kinetochore) | 第19-30页 |
| 1.3.1 内层动粒(Inner kinetochore) | 第21-25页 |
| 1.3.2 外层动粒(Outer kinetochore) | 第25-28页 |
| 1.3.3 着丝粒与微管的连接 | 第28-30页 |
| 1.4 着丝粒特异的组蛋白CENP-A | 第30-36页 |
| 1.4.1 组蛋白CENP-A | 第30-32页 |
| 1.4.2 CENP-A核小体 | 第32-34页 |
| 1.4.3 CENP-A核小体的定位 | 第34-36页 |
| 1.5 CENP-L/N复合物 | 第36-40页 |
| 1.5.1 着丝粒相关蛋白CENP-L/N | 第36-38页 |
| 1.5.2 CENP-L/N与着丝粒蛋白的相互作用 | 第38-40页 |
| 1.6 选题意义及研究内容 | 第40-42页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第42-70页 |
| 2.1 目的蛋白的基因扩增和质粒构建 | 第42-49页 |
| 2.1.1 目的基因扩增(PCR) | 第42-43页 |
| 2.1.2 PCR产物鉴定及回收 | 第43-44页 |
| 2.1.3 双酶切反应 | 第44页 |
| 2.1.4 连接反应 | 第44页 |
| 2.1.5 转化 | 第44-45页 |
| 2.1.6 重组子的鉴定 | 第45-46页 |
| 2.1.7 突变体质粒的构建 | 第46-49页 |
| 2.2 目的蛋白小量试表达 | 第49页 |
| 2.3 目的蛋白大量表达及纯化 | 第49-52页 |
| 2.3.1 扩大培养 | 第50页 |
| 2.3.2 Ni-NTA柱亲和层析纯化 | 第50-51页 |
| 2.3.3 GST柱亲和层析纯化 | 第51页 |
| 2.3.4 MBP柱亲和层析纯化 | 第51页 |
| 2.3.5 凝胶过滤层析纯化 | 第51-52页 |
| 2.4 昆虫细胞表达体系的蛋白表达及纯化 | 第52-57页 |
| 2.4.1 质粒构建(pACEBac1-CENP-N-C6H-pIDC-CENP-L) | 第52-53页 |
| 2.4.2 产生重组的杆状穿梭载体Bacmid | 第53-54页 |
| 2.4.3 产生重组杆状病毒Baculovirus | 第54-56页 |
| 2.4.4 CENP-L/N复合物蛋白表达 | 第56页 |
| 2.4.5 CENP-L/N复合物蛋白纯化 | 第56-57页 |
| 2.5 CENP-A组蛋白八聚体表达及纯化 | 第57-58页 |
| 2.5.1 CENP-A组蛋白八聚体表达 | 第57页 |
| 2.5.2 CENP-A组蛋白八聚体纯化 | 第57-58页 |
| 2.6 147 bp DNA片段纯化 | 第58-60页 |
| 2.7 CENP-A核小体重组及纯化 | 第60页 |
| 2.8 CENP-N与CENP-A核小体复合物纯化 | 第60-61页 |
| 2.8.1 CENP-N截短体与CENP-A核小体复合物纯化 | 第60-61页 |
| 2.8.2 CENP-LN与CENP-A核小体复合物纯化 | 第61页 |
| 2.9 晶体生长及优化 | 第61-62页 |
| 2.10 电镜样品制备 | 第62页 |
| 2.10.1 负染电镜样品的制备 | 第62页 |
| 2.10.3 冷冻电镜样品制备 | 第62页 |
| 2.11 冷冻电镜数据收集和三维重构 | 第62-66页 |
| 2.11.1 冷冻电镜样品质量检查和数据收集 | 第62-63页 |
| 2.11.2 冷冻电镜数据处理 | 第63-66页 |
| 2.11.3 CENP-A NCP/CENP-LN结构模型搭建 | 第66页 |
| 2.13 相互作用检测 | 第66-67页 |
| 2.13.1 Native-PAGE | 第66-67页 |
| 2.13.2 凝胶电泳迁移(EMSA) | 第67页 |
| 2.14 RNA干扰实验 | 第67-70页 |
| 2.14.1 细胞培养和同步化 | 第67-68页 |
| 2.14.2 免疫荧光与活细胞成像 | 第68-69页 |
| 2.14.3 数据统计 | 第69-70页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第70-112页 |
| 3.1 人源CENP-L/M/N的表达和纯化 | 第70-75页 |
| 3.1.1 CENP-L/N复合物的表达与纯化 | 第71-72页 |
| 3.1.2 CENP-N氨基端截短体的纯化 | 第72-75页 |
| 3.2 人源CENP-A核小体的重组纯化 | 第75-79页 |
| 3.2.1 CENP-A八聚体的纯化 | 第76-77页 |
| 3.2.2 CENP-A核小体的重组纯化 | 第77-79页 |
| 3.3 人源CENP-N的N端可与CENP-A核小体相互作用 | 第79-81页 |
| 3.4 人源CENP-N截短体与CENP-A核小体的复合物纯化和结晶 | 第81-85页 |
| 3.4.1 复合物纯化和结晶条件初筛 | 第81-84页 |
| 3.4.2 晶体筛选及优化 | 第84-85页 |
| 3.5 人源CENP-L/N与CENP-A核小体的复合物纯化 | 第85-86页 |
| 3.6 人源CENP-LN/CENP-A NCP复合物冷冻电镜数据收集及处理 | 第86-88页 |
| 3.7 人源CENP-L/N与CENP-A核小体复合物结构分析 | 第88-99页 |
| 3.7.1 整体结构分析 | 第88-93页 |
| 3.7.2 CENP-N特异性识别CENP-A的结构基础 | 第93-95页 |
| 3.7.3 CENP-N与DNA的相互作用稳定了复合物结构 | 第95-99页 |
| 3.8 CENP-N与核小体DNA的结合对动粒组装至关重要 | 第99-103页 |
| 3.8.1 CENP-N在有丝分裂过程中具有重要功能 | 第99-101页 |
| 3.8.2 CENP-N与核小体DNA的相互作用介导动粒的正常装配 | 第101-103页 |
| 3.9 酿酒酵母Im13~(CENP-L)/Ch14~(CENP-N)的表达纯化及晶体筛选 | 第103-108页 |
| 3.9.1 Im13~(CENP-L)/Ch14~(CENP-N)全长蛋白的表达纯化及晶体筛选 | 第103-105页 |
| 3.9.2 Ch14~(CENP-N)截短体蛋白的表达纯化及晶体筛选 | 第105-107页 |
| 3.9.3 Im13~(CENP-L)与Ch14~(CENP-N)嵌合体蛋白共表达纯化及晶体筛选 | 第107-108页 |
| 3.10 裂殖酵母Fta1~(CENP-L)/Mis17~(CENP-M)/Mis15~(CENP-N)的表达纯化及晶体筛选 | 第108-112页 |
| 3.10.1 Fta1~(CENP-L)/Mis17~(CENP-M)/Mis15~(CENP-N)全长蛋白的表达纯化 | 第108-109页 |
| 3.10.2 Fta1~(CENP-L)/Mis17~(CENP-M)/Mis15~(CENP-N)截短体蛋白的表达纯化及晶体筛选 | 第109-112页 |
| 本篇小结 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-130页 |
| 第二篇 金黄色葡萄球菌中糖酵解中蛋白Pfk的结构和功能研究 | 第130-182页 |
| 第四章 综述 | 第130-142页 |
| 4.1 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) | 第130-132页 |
| 4.2 糖酵解(glycolysis) | 第132-133页 |
| 4.3 ATP依赖的六磷酸果糖激酶(Pfk) | 第133-138页 |
| 4.3.1 真核生物的Pfk | 第134-135页 |
| 4.3.2 细菌的Pfk | 第135-136页 |
| 4.3.3 细菌Pfk的别构调节 | 第136-138页 |
| 4.4 RNA降解体 | 第138-139页 |
| 4.5 选题意义及研究内容 | 第139-142页 |
| 第五章 实验材料和方法 | 第142-156页 |
| 5.1 目的蛋白的基因扩增和质粒构建 | 第142页 |
| 5.2 目的蛋白的小量试表达 | 第142页 |
| 5.3 目的蛋白的大量表达及纯化 | 第142-143页 |
| 5.4 凝胶过滤层析 | 第143-144页 |
| 5.4.1 纯化 | 第143页 |
| 5.4.2 聚集状态分析 | 第143-144页 |
| 5.5 Sa_Pfk的X射线晶体学研究 | 第144-154页 |
| 5.5.1 Sa_Pfk结晶条件筛选和优化 | 第144-147页 |
| 5.5.2 Sa_Pfk的晶体衍射和数据收集 | 第147页 |
| 5.5.3 晶体衍射数据处理 | 第147-150页 |
| 5.5.4 初始模型的建立及精细修正 | 第150页 |
| 5.5.5 结构模型质量评估 | 第150-154页 |
| 5.6 等温量热滴定(ITC) | 第154页 |
| 5.7 Sa_Pfk的酶学活性分析 | 第154-156页 |
| 第六章 实验结果与讨论 | 第156-175页 |
| 6.1 Sa_Pfk在溶液中存在二体和四体两种状态 | 第156-157页 |
| 6.2 Sa_Pfk的聚集状态受多种因素调控 | 第157-160页 |
| 6.2.1 低pH会促使Sa_Pfk逐渐解离成二聚体 | 第157-158页 |
| 6.2.2 ADP/ATP/AMP-PNP会促使Sa_Pfk解离成二聚体 | 第158-159页 |
| 6.2.3 F6P会促使Sa_Pfk形成四聚体 | 第159-160页 |
| 6.3 Sa_Pfk的整体结构 | 第160-173页 |
| 6.3.1 Sa_Pfk的二聚体结构 | 第162-166页 |
| 6.3.2 Sa_Pfk的四聚体结构 | 第166-169页 |
| 6.3.3 Sa_Pfk二聚体与四聚体转换的分子机制研究 | 第169-173页 |
| 6.4 Sa_Pfk的酶学活性研究 | 第173-175页 |
| 本篇小结 | 第175-176页 |
| 参考文献 | 第176-182页 |
| 附录 | 第182-204页 |
| 致谢 | 第204-206页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第206页 |
