| 符号说明 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-15页 |
| Abstract | 第15-19页 |
| 1 前言 | 第20-32页 |
| 1.1 谷胱甘肽S-转移酶研究进展 | 第20-24页 |
| 1.1.1 谷胱甘肽S-转移酶的分类与进化 | 第20-21页 |
| 1.1.2 细胞质谷胱甘肽S-转移酶的结构特征 | 第21-22页 |
| 1.1.3 谷胱甘肽S-转移酶的功能 | 第22-24页 |
| 1.1.3.1 谷胱甘肽S-转移酶的功能概述 | 第22-23页 |
| 1.1.3.2 Omega族谷胱甘肽S-转移酶的功能 | 第23-24页 |
| 1.1.3.3 昆虫谷胱甘肽S-转移酶的作用机制 | 第24页 |
| 1.2 小分子热激蛋白研究进展 | 第24-30页 |
| 1.2.1 热激蛋白的发现与分类 | 第24-25页 |
| 1.2.2 小分子热激蛋白的结构特征 | 第25-27页 |
| 1.2.3 小分子热激蛋白的生物学功能 | 第27-30页 |
| 1.2.3.1 小分子热激蛋白的分子伴侣功能 | 第27-28页 |
| 1.2.3.2 小分子热激蛋白的抗氧化作用 | 第28-29页 |
| 1.2.3.3 小分子热激蛋白的抗低温作用 | 第29-30页 |
| 1.2.3.4 小分子热激蛋白的免疫作用 | 第30页 |
| 1.3 本研究的目的及意义 | 第30-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第32-35页 |
| 2.1.1 供试蜂种 | 第32页 |
| 2.1.2 菌株、质粒 | 第32页 |
| 2.1.3 酶与各种生化试剂 | 第32页 |
| 2.1.4 PCR引物 | 第32-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-58页 |
| 2.2.1 中华蜜蜂的饲养及处理 | 第35-36页 |
| 2.2.2 中华蜜蜂总RNA的提取、纯化及鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.2.1 利用TRIZOL Kit提取总RNA | 第36页 |
| 2.2.2.2 总RNA的纯化 | 第36页 |
| 2.2.2.3 总RNA的电泳鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成及纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.4 cDNA5'末端的加尾反应 | 第38页 |
| 2.2.5 目的DNA片段的回收、连接及转化 | 第38-40页 |
| 2.2.5.1 目的DNA片段的回收 | 第38-39页 |
| 2.2.5.2 目的DNA片段与克隆载体的连接 | 第39页 |
| 2.2.5.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| 2.2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第39-40页 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.2.6.1 质粒DNA的提取(试剂盒微量法) | 第40页 |
| 2.2.6.2 重组质粒DNA的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.2.7 DNA序列的测定 | 第41页 |
| 2.2.8 中华蜜蜂目的基因cDNA序列的获得 | 第41-44页 |
| 2.2.8.1 目的基因中间片段的获得 | 第41-43页 |
| 2.2.8.2 5'末端序列的获得(RACE法) | 第43页 |
| 2.2.8.3 3'末端序列的获得(RACE法) | 第43-44页 |
| 2.2.8.4 cDNA全长序列的获得 | 第44页 |
| 2.2.9 中华蜜蜂基因组DNA的提取(试剂盒小量法) | 第44-45页 |
| 2.2.10 中华蜜蜂目的基因基因组全长序列的获得 | 第45页 |
| 2.2.11 中华蜜蜂目的基因启动子序列的获得(反向PCR) | 第45-46页 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR分析基因的表达 | 第46-48页 |
| 2.2.12.1 内参引物、反应体系及反应条件的确定 | 第46-47页 |
| 2.2.12.2 实时荧光定量PCR分析 | 第47页 |
| 2.2.12.3 数据处理 | 第47-48页 |
| 2.2.13 双链RNA(dsRNA)的合成 | 第48-49页 |
| 2.2.13.1 dsRNA模板的制备 | 第48页 |
| 2.2.13.2 dsRNA的合成 | 第48-49页 |
| 2.2.13.3 dsRNA的注射 | 第49页 |
| 2.2.13.4 dsRNA的饲喂 | 第49页 |
| 2.2.14 目的基因的原核表达及纯化 | 第49-51页 |
| 2.2.14.1 原核表达载体的构建 | 第49页 |
| 2.2.14.2 重组基因原核表达的诱导 | 第49-50页 |
| 2.2.14.3 重组蛋白的纯化 | 第50页 |
| 2.2.14.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第50-51页 |
| 2.2.15 抗体的制备及检测 | 第51-53页 |
| 2.2.15.1 抗体的制备 | 第51-52页 |
| 2.2.15.2 ELISA检测抗体效价 | 第52页 |
| 2.2.15.3 Western blot分析 | 第52-53页 |
| 2.2.16 免疫组织化学技术 | 第53-54页 |
| 2.2.16.1 组织的分离处理 | 第53页 |
| 2.2.16.2 组织石蜡切片的制作 | 第53-54页 |
| 2.2.16.3 免疫组织酶化学分析 | 第54页 |
| 2.2.17 AccGSTO2的定点突变 | 第54-55页 |
| 2.2.18 AccGSTO2的酶学性质 | 第55页 |
| 2.2.18.1 酶活性测定 | 第55页 |
| 2.2.18.2 动力学常数的测定 | 第55页 |
| 2.2.18.3 最适温度的测定 | 第55页 |
| 2.2.18.4 最适pH的测定 | 第55页 |
| 2.2.19 AccGSTO2突变体荧光发射光谱的测定 | 第55-56页 |
| 2.2.20 抗氧化功能分析 | 第56页 |
| 2.2.20.1 DNA保护功能的测定 | 第56页 |
| 2.2.20.2 氧化应激下的纸盘扩散分析 | 第56页 |
| 2.2.21 AccsHSP22.6的耐温性分析和体外分子伴侣活性测定 | 第56-57页 |
| 2.2.21.1 耐温性分析 | 第56页 |
| 2.2.21.2 体外分子伴侣活性测定 | 第56-57页 |
| 2.2.22 生物信息学分析工具 | 第57-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-100页 |
| 3.1 中华蜜蜂AccGSTO2基因的分子特性和在氧化应激中的保护效应 | 第58-83页 |
| 3.1.1 中华蜜蜂AccGSTO2基因cDNA全长的获得及序列分析 | 第58-59页 |
| 3.1.2 中华蜜蜂AccGSTO2蛋白一级结构分析 | 第59-61页 |
| 3.1.3 AccGSTO2基因组结构分析 | 第61-62页 |
| 3.1.4 AccGSTO2启动子序列的分离及顺式作用元件的预测 | 第62-63页 |
| 3.1.5 AccGSTO2的表达特性分析 | 第63-69页 |
| 3.1.5.1 AccGSTO2基因表达的时间和空间特异性 | 第63-64页 |
| 3.1.5.2 AccGSTO2在不同非生物应激中的表达特性 | 第64-66页 |
| 3.1.5.3 AccGSTO2在不同生物应激中的表达特性 | 第66-67页 |
| 3.1.5.4 中华蜜蜂在CdCl_2和病原微生物应激中体内的氧化状态 | 第67-69页 |
| 3.1.6 AccGSTO2重组蛋白的原核表达及酶学特征 | 第69-73页 |
| 3.1.6.1 AccGSTO2重组蛋白诱导表达条件的优化 | 第69-71页 |
| 3.1.6.2 AccGSTO2重组蛋白的酶学特征 | 第71页 |
| 3.1.6.3 重组AccGSTO2蛋白在氧化应激中的保护效应 | 第71-73页 |
| 3.1.7 RNAi介导的AccGSTO2基因沉默 | 第73-77页 |
| 3.1.7.1 AccGSTO2基因最佳沉默时间的确定 | 第73-76页 |
| 3.1.7.2 AccGSTO2基因沉默对蜜蜂的影响 | 第76-77页 |
| 3.1.8 AccGSTO2的定点突变 | 第77-83页 |
| 3.1.8.1 AccGSTO2突变体的构建、表达纯化及动力学分析 | 第77-78页 |
| 3.1.8.2 AccGSTO2突变体的抗氧化功能分析 | 第78-80页 |
| 3.1.8.3 AccGSTO2突变体的荧光光谱分析 | 第80页 |
| 3.1.8.4 AccGSTO2突变体的空间结构分析 | 第80-83页 |
| 3.2 中华蜜蜂AccsHsp22.6基因的分子特性及功能分析 | 第83-100页 |
| 3.2.1 中华蜜蜂AccsHsp22.6基因cDNA全长的获得及序列分析 | 第83-84页 |
| 3.2.2 中华蜜蜂AccsHSP22.6蛋白一级结构分析 | 第84-87页 |
| 3.2.3 AccsHsp22.6基因组结构分析 | 第87页 |
| 3.2.4 AccsHsp22.6启动子序列的分离及顺式作用元件的预测 | 第87-89页 |
| 3.2.5 AccsHsp22.6的表达特性分析 | 第89-93页 |
| 3.2.5.1 AccsHsp22.6基因表达的时间和空间特异性 | 第89-90页 |
| 3.2.5.2 AccsHsp22.6在不同非生物应激下的表达特性 | 第90-91页 |
| 3.2.5.3 AccsHsp22.6在不同生物应激下的表达特性 | 第91-93页 |
| 3.2.6 AccsHSP22.6重组蛋白的原核表达及功能分析 | 第93-97页 |
| 3.2.6.1 AccsHSP22.6重组蛋白诱导表达条件的优化 | 第93-95页 |
| 3.2.6.2 AccsHSP22.6重组蛋白的耐温性分析 | 第95页 |
| 3.2.6.3 过表达AccsHsp22.6大肠杆菌的纸盘扩散分析 | 第95-96页 |
| 3.2.6.4 重组蛋白AccsHSP22.6的体外分子伴侣功能 | 第96-97页 |
| 3.2.7 RNAi介导的AccsHsp22.6基因沉默 | 第97-100页 |
| 3.2.7.1 AccsHsp22.6基因最佳沉默时间的确定 | 第97-98页 |
| 3.2.7.2 AccsHsp22.6基因沉默对蜜蜂耐温能力的影响 | 第98-100页 |
| 4 讨论 | 第100-107页 |
| 5 小结 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-118页 |
| 附件 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第120页 |
