| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第13-29页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 | 第13页 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌的生长周期 | 第13-14页 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌的功能基因组学研究 | 第14-15页 |
| 1.4 细菌第二信使环鸟苷二磷酸c-di-GMP的相关研究 | 第15-28页 |
| 1.4.1 c-di-GMP的代谢途径 | 第15-20页 |
| 1.4.1.1 含GGDEF和EAL保守结构域蛋白控制细胞内c-di-GMP的水平 | 第17-20页 |
| 1.4.1.2 含HD-GYP结构域蛋白具有PDE活性 | 第20页 |
| 1.4.2 c-di-GMP的作用机理 | 第20-24页 |
| 1.4.2.1 含PilZ结构域的蛋白参与c-di-GMP的调控 | 第21-22页 |
| 1.4.2.2 具有I位点的和退化的DGC影响c-di-GMP的调控 | 第22页 |
| 1.4.2.3 c-di-GMP的转录因子类受体 | 第22-23页 |
| 1.4.2.4 c-di-GMP的核酸开关 | 第23-24页 |
| 1.4.3 c-di-GMP的生物学功能 | 第24-26页 |
| 1.4.3.1 调控生物膜的形成 | 第24-25页 |
| 1.4.3.2 调节细菌运动性 | 第25页 |
| 1.4.3.3 影响毒力因子的形成 | 第25-26页 |
| 1.4.4 c-di-GMP信号传递途径与其他信号通路的关系 | 第26-27页 |
| 1.4.5 c-di-GMP的待研究热点 | 第27-28页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第28-29页 |
| 2 材料和方法 | 第29-43页 |
| 2.1 材料 | 第29-35页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第29-32页 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 | 第32页 |
| 2.1.3 主要培养基及溶液的配制 | 第32-34页 |
| 2.1.3.1 培养基的配制 | 第32-33页 |
| 2.1.3.2 抗生素的配制 | 第33页 |
| 2.1.3.3 其它溶液的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.3.4 感受态相关溶液的配制 | 第34页 |
| 2.1.3.5 蛋白纯化常用溶液的配制 | 第34页 |
| 2.1.3.6 SDS-PAGE(Tris-glycine系统)相关溶液的配制 | 第34页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第34-35页 |
| 2.2 方法 | 第35-43页 |
| 2.2.1 生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.2.2 异源表达载体的构建 | 第35页 |
| 2.2.2.1 BMB171总DNA提取 | 第35页 |
| 2.2.2.2 各目的基因的PCR扩增 | 第35页 |
| 2.2.2.3 各异源表达载体的构建 | 第35页 |
| 2.2.2.4 感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.2.5 各重组质粒的转化和阳性克隆子的验证 | 第35页 |
| 2.2.3 目的蛋白的表达、纯化及活性分析 | 第35-37页 |
| 2.2.3.1 各重组质粒的小量表达检测 | 第35-36页 |
| 2.2.3.2 各目的蛋白的Ni~(2+)-NTA亲和纯化 | 第36页 |
| 2.2.3.3 各目的蛋白浓度的测定 | 第36页 |
| 2.2.3.4 大肠杆菌沉降表型检测目的蛋白酶活性(体内检测) | 第36页 |
| 2.2.3.5 HPLC分别检测目的蛋白酶活性(体外检测) | 第36-37页 |
| 2.2.3.6 LC-MS分别验证目的蛋白酶活性 | 第37页 |
| 2.2.4 苏云金芽胞杆菌中c-di-GMP相关基因的RT-PCR检测 | 第37-39页 |
| 2.2.4.1 RNA的抽提 | 第37-38页 |
| 2.2.4.2 第一链cDNA的合成 | 第38页 |
| 2.2.4.3 利用不同时期cDNA进行c-di-GMP相关基因的PCR扩增 | 第38-39页 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌中c-di-GMP活性基因缺失突变株的筛选 | 第39-40页 |
| 2.2.5.1 筛选缺失突变株的基本原理 | 第39页 |
| 2.2.5.2 基因敲除载体的构建 | 第39页 |
| 2.2.5.3 基因敲除实验方法 | 第39-40页 |
| 2.2.5.4 单交换重组子的验证 | 第40页 |
| 2.2.5.5 双交换重组子的验证 | 第40页 |
| 2.2.5.6 质粒消除以及测序结果的验证 | 第40页 |
| 2.2.6 出发菌株BMB171与敲除突变株体内c-di-GMP测定 | 第40-41页 |
| 2.2.7 出发菌株BMB171与各敲除突变株的表型比较 | 第41-43页 |
| 2.2.7.1 出发菌株与各敲除突变株运动性观测 | 第41页 |
| 2.2.7.2 出发菌株与各敲除突变株沉降观测 | 第41页 |
| 2.2.7.3 出发菌株与各敲除突变株生物膜形成的观测 | 第41页 |
| 2.2.7.4 出发菌株与各敲除突变株菌体形态观测 | 第41页 |
| 2.2.7.5 出发菌株与各敲除突变株生长曲线的观测 | 第41-42页 |
| 2.2.7.6 出发菌株与各敲除突变株对2μg/mL Nisin耐受性测定 | 第42页 |
| 2.2.7.7 出发菌株与各敲除突变株低温耐受性的测定 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-70页 |
| 3.1 BMB171中GGDEF/EAL保守结构域 | 第43-44页 |
| 3.2 异源表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.3 目的蛋白的表达、纯化及活性分析 | 第45-55页 |
| 3.3.1 目的蛋白的诱导表达及纯化 | 第45-49页 |
| 3.3.2 大肠杆菌沉降表型检测目的蛋白酶活性(体内检测) | 第49-50页 |
| 3.3.3 目的蛋白体外酶活性分析 | 第50-53页 |
| 3.3.3.1 对预测的合成酶活性检测 | 第50-52页 |
| 3.3.3.2 对预测的降解酶活性检测 | 第52页 |
| 3.3.3.3 对预测的双结构域酶活性检测 | 第52-53页 |
| 3.3.4 LC-MS酶活性的验证 | 第53-55页 |
| 3.4 苏云金芽胞杆菌中c-di-GMP相关基因的RT-PCR检测 | 第55-57页 |
| 3.5 苏云金芽胞杆菌中c-di-GMP活性基因敲除突变株的筛选 | 第57-70页 |
| 3.5.1 c-di-GMP活性基因敲除载体的构建 | 第57页 |
| 3.5.2 c-di-GMP活性基因敲除突变株的筛选 | 第57-64页 |
| 3.5.2.1 △C0550和△C3653单敲除突变株的筛选 | 第58-60页 |
| 3.5.2.2 △C0550△C0469和△C3653△C0469双敲除突变株的筛选 | 第60-62页 |
| 3.5.2.3 △C0550△C0469△C3420三敲除突变株的筛选 | 第62-64页 |
| 3.5.3 出发菌株BMB171与敲除株体内c-di-GMP含量的测定 | 第64-65页 |
| 3.5.4 出发菌株BMB171与敲除突变株的表型检测 | 第65-70页 |
| 3.5.4.1 运动性检测 | 第65-66页 |
| 3.5.4.2 菌体沉降检测 | 第66-67页 |
| 3.5.4.3 生物膜检测 | 第67-68页 |
| 3.5.4.4 菌体形态检测 | 第68页 |
| 3.5.4.5 生长曲线测定 | 第68-69页 |
| 3.5.4.6 Nisin抗性检测 | 第69-70页 |
| 3.5.4.7 低温耐受性检测 | 第70页 |
| 4 结果与讨论 | 第70-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
