| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 引言 | 第14-26页 |
| 1 实时荧光定量PCR技术概述 | 第14-18页 |
| 1.1 实时荧光定量PCR基本原理 | 第14-15页 |
| 1.2 实时荧光定量PCR检测方法 | 第15-16页 |
| 1.2.1 荧光嵌合法（SYBR GreenⅠ） | 第15页 |
| 1.2.2 TaqMan探针法 | 第15-16页 |
| 1.2.3 分子信标法（Molecular beacons） | 第16页 |
| 1.3 实时荧光定量PCR技术的定量方法 | 第16-17页 |
| 1.3.1 绝对定量法 | 第16-17页 |
| 1.3.2 相对定量法 | 第17页 |
| 1.4 实时荧光定量PCR在植物植物病理学研究中的应用 | 第17-18页 |
| 2 内参基因概述 | 第18-19页 |
| 2.1 常用的内参基因 | 第18页 |
| 2.2 内参基因的选择 | 第18-19页 |
| 3 苹果病毒病概述 | 第19-24页 |
| 3.1 苹果病毒病概况 | 第19-20页 |
| 3.2 苹果病毒的传播途径 | 第20页 |
| 3.3 苹果病毒病的防控措施 | 第20-21页 |
| 3.4 苹果潜隐性病毒的检测方法 | 第21-23页 |
| 3.4.1 指示植物法 | 第21页 |
| 3.4.2 电子显微镜技术 | 第21-22页 |
| 3.4.3 血清学方法 | 第22页 |
| 3.4.3 分子生物学技术 | 第22-23页 |
| 3.5 三种苹果潜隐性病毒 | 第23-24页 |
| 3.5.1 苹果茎沟病毒 | 第23-24页 |
| 3.5.2 苹果茎痘病毒 | 第24页 |
| 3.5.3 苹果褪绿叶斑病毒 | 第24页 |
| 4 本研究的目的意义 | 第24-26页 |
| 第二章 苹果六个内参基因的优选 | 第26-43页 |
| 1 材料与方法 | 第26-31页 |
| 1.1 试验材料 | 第26页 |
| 1.2 主要仪器及试剂 | 第26页 |
| 1.2.1 主要仪器 | 第26页 |
| 1.2.2 主要试剂 | 第26页 |
| 1.3 试验方法 | 第26-31页 |
| 1.3.1 总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 1.3.2 总RNA完整性和纯度的检测 | 第27页 |
| 1.3.3 总RNA的纯化 | 第27-28页 |
| 1.3.4 cDNA的合成 | 第28页 |
| 1.3.5 引物的设计与合成 | 第28-29页 |
| 1.3.6 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度筛选 | 第29-30页 |
| 1.3.7 六个内参基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应 | 第30页 |
| 1.3.8 数据分析 | 第30-31页 |
| 2 结果与分析 | 第31-41页 |
| 2.1 总RNA的提取 | 第31页 |
| 2.2 总RNA的纯化及cDNA合成 | 第31-32页 |
| 2.3 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度的筛选 | 第32-35页 |
| 2.4 六个内参基因的实时荧光定量PCR反应 | 第35-40页 |
| 2.5 六个内参基因的筛选 | 第40-41页 |
| 2.5.1 六个内参基因的表达水平分析 | 第40页 |
| 2.5.2 六个内参基因的稳定性分析 | 第40-41页 |
| 3 讨论 | 第41-43页 |
| 第三章 苹果Actin基因TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 | 第43-57页 |
| 1 材料与方法 | 第43-50页 |
| 1.1 试验材料 | 第43页 |
| 1.2 主要试剂及仪器 | 第43页 |
| 1.3 总RNA的提取 | 第43页 |
| 1.4 cDNA的合成 | 第43页 |
| 1.5 引物与探针的设计与合成 | 第43-44页 |
| 1.6 阳性重组质粒的构建 | 第44-47页 |
| 1.6.1 Actin基因的常规PCR扩增 | 第44页 |
| 1.6.2 目标片段的回收 | 第44-45页 |
| 1.6.3 目标片段的克隆 | 第45页 |
| 1.6.4 重组质粒的提取 | 第45-46页 |
| 1.6.5 重组质粒的鉴定 | 第46-47页 |
| 1.7 cRNA标准品的制备 | 第47-48页 |
| 1.7.1 阳性重组质粒的线性化处理 | 第47页 |
| 1.7.2 cRNA的体外转录及纯化 | 第47-48页 |
| 1.8 Actin基因TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系的建立 | 第48-50页 |
| 1.8.1 标准曲线的制作 | 第48-49页 |
| 1.8.2 反应体系与常规RT-PCR灵敏度的对比 | 第49页 |
| 1.8.3 反应体系的特异性 | 第49页 |
| 1.8.4 反应体系的重复性 | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-56页 |
| 2.1 Actin基因的常规PCR扩增及其产物的回收 | 第50-51页 |
| 2.2 阳性重组质粒的构建及鉴定 | 第51-53页 |
| 2.3 cRNA的体外转录 | 第53页 |
| 2.4 实时荧光定量RT- PCR标准曲线的制作 | 第53页 |
| 2.5 实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度的对比 | 第53-55页 |
| 2.6 实时荧光定量PCR的重复性 | 第55页 |
| 2.7 实时荧光定量PCR的特异性 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第57-66页 |
| 1 材料与方法 | 第57-59页 |
| 1.1 材料 | 第57页 |
| 1.2 主要试剂和仪器： | 第57页 |
| 1.3 引物和探针的设计合成 | 第57-58页 |
| 1.4 总RNA的提取及cDNA的合成 | 第58页 |
| 1.5 阳性质粒标准品的构建 | 第58页 |
| 1.6 标准曲线的绘制 | 第58-59页 |
| 1.7 实时荧光定量RT-PCR反应体系的方法学测试 | 第59页 |
| 1.7.1 实时荧光定量RT-PCR的特异性试验 | 第59页 |
| 1.7.2 实时荧光定量RT-PCR的灵敏性试验 | 第59页 |
| 1.7.3 实时荧光定量RT-PCR的重复性试验 | 第59页 |
| 1.8 实际样品的检测 | 第59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-65页 |
| 2.1 阳性质粒标准品的构建 | 第59-60页 |
| 2.2 标准曲线的建立 | 第60-61页 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR特异性 | 第61页 |
| 2.4 实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR灵敏度的比较 | 第61-62页 |
| 2.5 实时荧光定量RT-PCR重复性 | 第62-63页 |
| 2.6 实际样品检测 | 第63-65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| 第五章 苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第66-72页 |
| 1 材料与方法 | 第66-68页 |
| 1.1 材料 | 第66页 |
| 1.2 方法 | 第66-68页 |
| 1.2.1 引物及探针的设计与合成 | 第66-67页 |
| 1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成 | 第67页 |
| 1.2.3 重组质粒标准品的制备及标准曲线绘制 | 第67页 |
| 1.2.4 实时荧光定量RT-PCR特异性、灵敏性、重复性试验 | 第67-68页 |
| 1.2.5 实际样品检测 | 第68页 |
| 2 结果与分析 | 第68-71页 |
| 2.1 重组质粒标准品的鉴定及标准曲线的绘制 | 第68页 |
| 2.2 实时荧光定量RT-PCR的特异性 | 第68-69页 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度 | 第69-70页 |
| 2.4 实时荧光定量RT- PCR的重复性 | 第70页 |
| 2.5 实际样品检测结果 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 第六章 苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第72-80页 |
| 1 材料与方法 | 第72-74页 |
| 1.1 材料 | 第72页 |
| 1.2 引物及探针的设计与合成 | 第72-73页 |
| 1.3 总RNA的提取及RT-PCR | 第73页 |
| 1.4 阳性质粒的构建 | 第73页 |
| 1.5 标准品cRNA的制备及标准曲线的绘制 | 第73-74页 |
| 1.6 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证与实际样品检测 | 第74页 |
| 2 结果与分析 | 第74-79页 |
| 2.1 阳性质粒的构建 | 第74-75页 |
| 2.2 标准曲线的绘制 | 第75页 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR的特异性 | 第75-76页 |
| 2.4 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度 | 第76-77页 |
| 2.5 实时荧光定量RT-PCR的重复性 | 第77页 |
| 2.6 实际样品的检测结果 | 第77-79页 |
| 3 讨论 | 第79-80页 |
| 结论 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-90页 |
| 在读期间发表的论文 | 第90-91页 |
| 作者简历 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
