| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 综述 | 第12-20页 |
| 1.1 淀粉酶概述 | 第12-13页 |
| 1.2 α-淀粉酶 | 第13-15页 |
| 1.2.1 α-淀粉酶来源及性质 | 第13页 |
| 1.2.2 α-淀粉酶的结构及催化机制 | 第13-14页 |
| 1.2.3 α-淀粉酶基因的克隆与表达 | 第14-15页 |
| 1.3 葡萄糖淀粉酶 | 第15-17页 |
| 1.3.1 葡萄糖淀粉酶来源及性质 | 第15页 |
| 1.3.2 葡萄糖淀粉酶结构和催化机制 | 第15-16页 |
| 1.3.3 葡萄糖淀粉酶基因的克隆和异源表达 | 第16-17页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统概况 | 第17页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达异源蛋白影响因素 | 第17-18页 |
| 1.4.3 淀粉酶在毕赤酵母中的表达 | 第18页 |
| 1.5 本课题立题依据及目标 | 第18-20页 |
| 第二章 淀粉酶产生菌的筛选及鉴定 | 第20-28页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 材料 | 第20-21页 |
| 2.2.1 土样来源 | 第20页 |
| 2.2.2 培养基 | 第20-21页 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 | 第21页 |
| 2.3 试验方法 | 第21-23页 |
| 2.3.1 产淀粉酶丝状真菌筛选方案 | 第21-22页 |
| 2.3.2 菌种鉴定 | 第22页 |
| 2.3.3 酶活测定方法 | 第22-23页 |
| 2.4 结果与分析 | 第23-26页 |
| 2.4.1 产淀粉酶丝状真菌筛选 | 第23页 |
| 2.4.2 菌种鉴定 | 第23-24页 |
| 2.4.3 粗酶液酶活与酶学性质测定 | 第24-26页 |
| 2.5 筛菌小结 | 第26-28页 |
| 第三章 微小毛霉α-淀粉酶基因克隆、表达及鉴定 | 第28-44页 |
| 3.1 前言 | 第28页 |
| 3.2 材料 | 第28-29页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第28页 |
| 3.2.2 工具酶和试剂 | 第28页 |
| 3.2.3 培养基 | 第28-29页 |
| 3.2.4 PCR引物 | 第29页 |
| 3.3 实验方法 | 第29-35页 |
| 3.3.1 微小毛霉α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第29-31页 |
| 3.3.1.1 总RNA提取 | 第29-30页 |
| 3.3.1.2 第一链cDNA合成 | 第30页 |
| 3.3.1.3 a-淀粉酶基因克隆与分析 | 第30-31页 |
| 3.3.2 微小毛霉α-淀粉酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第31-34页 |
| 3.3.2.1 微小毛霉α-淀粉酶毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第31页 |
| 3.3.2.2 线性质粒DNA制备 | 第31-32页 |
| 3.3.2.3 毕赤酵母感受态制备 | 第32页 |
| 3.3.2.4 毕赤酵母转化 | 第32页 |
| 3.3.2.5 毕赤酵母转化子产淀粉酶活性验证 | 第32-33页 |
| 3.3.2.6 毕赤酵母高拷贝转化子筛选 | 第33页 |
| 3.3.2.7 毕赤酵母诱导表达以及产酶曲线的绘制 | 第33页 |
| 3.3.2.8 SDS-PAGE | 第33页 |
| 3.3.2.9 蛋白浓度测定 | 第33-34页 |
| 3.3.2.10 酶活测定 | 第34页 |
| 3.3.3 微小毛霉α-淀粉酶酶学性质测定 | 第34-35页 |
| 3.3.3.1 温度对R.pAmy酶活力的影响 | 第34页 |
| 3.3.3.2 pH对R.pAmy酶活力的影响 | 第34页 |
| 3.3.3.3 R.pAmy水解可溶性淀粉的产物分析 | 第34-35页 |
| 3.4 结果与分析 | 第35-43页 |
| 3.4.1 微小毛霉(Rhizomucor pussillus)GX-3总RNA的提取 | 第35页 |
| 3.4.2 微小毛霉α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第35-36页 |
| 3.4.3 毕赤酵母表达载体的构建 | 第36页 |
| 3.4.4 毕赤酵母的转化 | 第36-37页 |
| 3.4.5 毕赤酵母转化子淀粉酶活性验证 | 第37页 |
| 3.4.6 高拷贝转化子的筛选 | 第37-38页 |
| 3.4.7 基因拷贝数对毕赤酵母表达微小毛霉α-淀粉酶基因的影响 | 第38-39页 |
| 3.4.8 微小毛霉α-淀粉酶毕赤酵母重组菌诱导表达产酶曲线 | 第39-40页 |
| 3.4.9 微小毛霉α-淀粉酶的酶学性质 | 第40-43页 |
| 3.5 讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 微小毛霉葡萄糖淀粉酶基因克隆、表达及其鉴定 | 第44-62页 |
| 4.1 引言 | 第44页 |
| 4.2 材料与方法 | 第44-50页 |
| 4.2.1 工具酶与试剂 | 第44页 |
| 4.2.2 微小毛霉葡萄糖淀粉酶基因克隆 | 第44-49页 |
| 4.2.2.1 葡萄糖淀粉酶保守片段克隆与分析 | 第44-46页 |
| 4.2.2.2 葡萄糖淀粉酶全长DNA克隆与分析 | 第46-48页 |
| 4.2.2.3 葡萄糖淀粉酶cDNA序列克隆与分析 | 第48-49页 |
| 4.2.3 葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中表达 | 第49-50页 |
| 4.2.3.1 葡萄糖淀粉酶毕赤酵母表达载体构建 | 第49页 |
| 4.2.3.2 毕赤酵母转化 | 第49页 |
| 4.2.3.3 葡萄糖淀粉酶重组毕赤酵母产酶活性验证 | 第49页 |
| 4.2.3.4 葡萄糖淀粉酶重组毕赤酵母诱导表达 | 第49-50页 |
| 4.2.3.5 葡萄糖淀粉酶诱导表达分析 | 第50页 |
| 4.2.4 微小毛霉葡萄糖淀粉酶酶学性质测定 | 第50页 |
| 4.2.4.1 温度对R.pGLA酶活力的影响 | 第50页 |
| 4.2.4.2 pH对R.pGLA酶活力的影响 | 第50页 |
| 4.2.4.3 葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉产物分析 | 第50页 |
| 4.3 结果与分析 | 第50-60页 |
| 4.3.1 微小毛霉葡萄糖淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第50-55页 |
| 4.3.1.1 葡萄糖淀粉酶保守片段的扩增与分析 | 第50-52页 |
| 4.3.1.2 葡萄糖淀粉酶全长DNA的扩增与分析 | 第52-53页 |
| 4.3.1.3 葡萄糖淀粉酶cDNA序列克隆 | 第53-55页 |
| 4.3.2 微小毛霉葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中的表达 | 第55-57页 |
| 4.3.2.1 毕赤酵母表达载体的构建 | 第55页 |
| 4.3.2.2 重组毕赤酵母高拷贝转化子筛选和产淀粉酶活性验证 | 第55-56页 |
| 4.3.2.3 基因拷贝数对毕赤酵母表达微小毛霉葡萄糖淀粉酶基因的影响 | 第56-57页 |
| 4.3.3 微小毛霉葡萄糖淀粉酶的酶学性质 | 第57-60页 |
| 4.4 讨论 | 第60-62页 |
| 第五章 微小毛霉α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶在毕赤酵母中的共表达 | 第62-70页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-64页 |
| 5.2.1 载体和抗生素 | 第62页 |
| 5.2.2 引物 | 第62页 |
| 5.2.3 载体构建 | 第62-63页 |
| 5.2.4 毕赤酵母转化 | 第63页 |
| 5.2.5 活性验证 | 第63页 |
| 5.2.6 重组转化子PCR验证 | 第63页 |
| 5.2.7 毕赤酵母诱导表达以及产酶曲线的绘制 | 第63页 |
| 5.2.8 毕赤酵母蛋白表达分析和酶学性质测定 | 第63-64页 |
| 5.3 结果与分析 | 第64-69页 |
| 5.3.1 表达载体构建 | 第64页 |
| 5.3.2 重组毕赤酵母转化、筛选与PCR验证 | 第64-65页 |
| 5.3.3 毕赤酵母转化子产淀粉酶活性验证 | 第65-66页 |
| 5.3.4 重组毕赤酵母异源蛋白表达分析和产酶曲线 | 第66-68页 |
| 5.3.5 KM71/9KGLA-ZαAmy表达混合酶水解淀粉产物分析 | 第68-69页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第69-70页 |
| 第六章 总结与展望 | 第70-72页 |
| 6.1 总结 | 第70-71页 |
| 6.2 展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 已投稿或者待发表的科研成果 | 第79页 |
