| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一部分 前言 | 第12-19页 |
| 1.1 细胞自噬简介 | 第12-16页 |
| 1.1.1 细胞自噬的概念和分类 | 第12-13页 |
| 1.1.2 细胞自噬的发生过程 | 第13-14页 |
| 1.1.3 细胞自噬的特性 | 第14-15页 |
| 1.1.4 细胞自噬与细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD) | 第15-16页 |
| 1.2 细胞自噬发生的分子机制 | 第16-18页 |
| 1.2.1 自噬相关基因与相关蛋白 | 第16页 |
| 1.2.2 自噬发生的分子机制 | 第16-17页 |
| 1.2.3 自噬相关基因Atg6(Autophagy-related-gene-6) | 第17-18页 |
| 1.3 棉铃虫简介 | 第18页 |
| 1.4 本课题研究目的与意义 | 第18-19页 |
| 第二部分 实验材料 | 第19-28页 |
| 2.1 细胞系和细胞培养基 | 第19页 |
| 2.2 质粒和菌株 | 第19页 |
| 2.3 实验动物 | 第19-20页 |
| 2.3.1 棉铃虫 | 第19页 |
| 2.3.2 小鼠 | 第19-20页 |
| 2.4 主要实验药品与试剂 | 第20-21页 |
| 2.5 常用溶液及其配制 | 第21-24页 |
| 2.5.1 碱裂解法提取质粒DNA所用溶液 | 第21页 |
| 2.5.2 PBS(磷酸盐缓冲液) | 第21页 |
| 2.5.3 5×TBE | 第21页 |
| 2.5.4 转染用无血清Grace's | 第21页 |
| 2.5.5 蛋白质凝胶电泳所用溶液 | 第21-22页 |
| 2.5.6 蛋白免疫印迹(Western Blo)相关的溶液 | 第22-23页 |
| 2.5.7 蛋白质凝胶的配制 | 第23页 |
| 2.5.8 卡那霉素(Kanamycin)与氨苄青霉素(Ampicillin) | 第23-24页 |
| 2.6 常用培养基的配制 | 第24-26页 |
| 2.6.1 昆虫Grace's Insect Cell Culture Medium | 第24页 |
| 2.6.2 液体LB培养基 | 第24页 |
| 2.6.3 固体LB培养基 | 第24页 |
| 2.6.4 棉铃虫人工饲料的配制 | 第24-26页 |
| 2.7 主要实验仪器与型号 | 第26-27页 |
| 2.8 实验中用到引物的名称和及其引物序列 | 第27-28页 |
| 第三部分 实验方法 | 第28-37页 |
| 3.1 棉铃虫自噬相关基因Atg6干扰片段的克隆 | 第28-30页 |
| 3.1.1 棉铃虫Atg6的基因序列分析 | 第28页 |
| 3.1.2 棉铃虫Atg6基因RNA干扰片段选取 | 第28-29页 |
| 3.1.3 干扰片段的扩增 | 第29-30页 |
| 3.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的克隆 | 第30-32页 |
| 3.2.1 用clustalx软件比对家蚕Atg6和棉铃虫细胞Ha-Atg6的ORF | 第30-31页 |
| 3.2.2 干扰片段的选取和目的基因的扩增 | 第31-32页 |
| 3.3 棉铃虫四龄幼虫中肠的解剖和冻存 | 第32页 |
| 3.4 棉铃虫中肠总RNA的提取 | 第32-33页 |
| 3.5 Ha-Atg6 cDNA的合成 | 第33页 |
| 3.5.1 基因组DNA的去除 | 第33页 |
| 3.5.2 cDNA的合成 | 第33页 |
| 3.6 dsRNA注射棉铃虫 | 第33-34页 |
| 3.7 实时荧光定量PCR反应体系 | 第34-35页 |
| 3.8 棉铃虫生长繁殖指标统计 | 第35-36页 |
| 3.9 dsRNA的合成 | 第36-37页 |
| 第四部分 实验结果 | 第37-52页 |
| 4.1 目的基因Atg6蛋白的表达和多克隆抗体的制备 | 第37页 |
| 4.2 不同昆虫细胞系中Atg6蛋白的差异表达 | 第37-39页 |
| 4.3 无血清培养条件下Bme细胞中Atg6蛋白表达的变化 | 第39页 |
| 4.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系研究 | 第39-41页 |
| 4.4.1 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的扩增和dsRNA的合成 | 第39-40页 |
| 4.4.2 合成的TH-Atg6-dsRNA干扰效果的检测 | 第40页 |
| 4.4.3 TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系 | 第40-41页 |
| 4.5 斜纹夜蛾TH细胞和粉纹夜蛾TnH_5细胞中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究 | 第41-44页 |
| 4.5.1 粉纹夜蛾细胞TnH_5-Atg6干扰片段的基因克隆及其dsRNA的合成 | 第41-42页 |
| 4.5.2 TH-Atg6-dsRNA和TnH_5-Atg6-dsRNA干扰效率的检测 | 第42-43页 |
| 4.5.3 斜纹夜蛾细胞TH和粉纹夜蛾细胞TnH5中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究(western-blot方法) | 第43页 |
| 4.5.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰48h后Atg8转录子的相对定量结果 | 第43-44页 |
| 4.6 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响 | 第44-45页 |
| 4.6.1 重组质粒转染效率的检测 | 第44-45页 |
| 4.6.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响探究 | 第45页 |
| 4.7 棉铃虫Atg6基因进化树 | 第45-46页 |
| 4.8 棉铃虫自噬相关基因Atg6和对照GFP基因干扰片断的PCR扩增以及dsRNA的合成 | 第46-47页 |
| 4.9 棉铃虫Atg6-dsRNA沉默了Atg6基因的表达 | 第47-48页 |
| 4.9.1 荧光定量PCR产物特异性分析 | 第47页 |
| 4.9.2 棉铃虫四龄幼虫中肠组织中Atg6转录子的相对定量检测 | 第47-48页 |
| 4.10 棉铃虫Atg6基因沉默对其生长发育的影响 | 第48-50页 |
| 4.10.1 Ha-Atg6基因沉默对棉铃虫体重无显著影响 | 第48-49页 |
| 4.10.2 Atg6基因的沉默使棉铃虫产卵量下降 | 第49-50页 |
| 4.10.3 Atg6基因沉默使棉铃虫孵化率减小 | 第50页 |
| 4.11 qRT-PCR方法对棉铃虫Atg6干扰最适计量的探究 | 第50-52页 |
| 第五部分 讨论 | 第52-54页 |
| 5.1 Atg6介导的昆虫细胞自噬研究 | 第52页 |
| 5.2 Atg6对棉铃虫繁殖的影响研究 | 第52-54页 |
| 5.2.1 棉铃虫Atg6基因dsRNA注射虫体降低虫体内该基因mRNA水平 | 第52-53页 |
| 5.2.2 棉铃虫Atg6基因表达沉默使虫体繁殖能力下降 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 硕士期间合作发表论文 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
