| 中文摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 符号说明 | 第16-18页 |
| 文献综述 | 第18-47页 |
| 综述一 K88+产肠毒素大肠杆菌毒力因子研究进展 | 第18-26页 |
| 1. 黏附素 | 第18-19页 |
| 1.1 K88菌毛 | 第18页 |
| 1.2 Ⅰ型菌毛 | 第18-19页 |
| 1.3 共生菌毛 | 第19页 |
| 1.4 非菌毛黏附素 | 第19页 |
| 2. 肠毒素 | 第19-20页 |
| 2.1 热敏肠毒素 | 第19页 |
| 2.2 热稳定肠毒素 | 第19-20页 |
| 2.3 肠聚集性耐热毒素 | 第20页 |
| 3. 其他毒力因子 | 第20-21页 |
| 3.1 溶血素 | 第20页 |
| 3.2 SepA | 第20-21页 |
| 展望 | 第21页 |
| 参考文献 | 第21-26页 |
| 综述二 大肠杆菌鞭毛研究进展 | 第26-47页 |
| 1. 鞭毛的结构和装配 | 第26-27页 |
| 2. 鞭毛表达的基因调节 | 第27-29页 |
| 3. 大肠杆菌鞭毛H抗原分型 | 第29-31页 |
| 4. 鞭毛的功能 | 第31-35页 |
| 4.1 运动性和趋化性 | 第31-32页 |
| 4.2 鞭毛Ⅲ型分泌系统 | 第32-33页 |
| 4.3 鞭毛影响细菌黏附 | 第33-34页 |
| 4.4 鞭毛介导的生物被膜形成 | 第34-35页 |
| 4.5 鞭毛蛋白刺激机体产生促炎性反应 | 第35页 |
| 5. 研究展望 | 第35-36页 |
| 参考文献 | 第36-47页 |
| 试验研究 | 第47-127页 |
| 研究一 K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛的协同调控 | 第47-74页 |
| 1. 材料 | 第48-49页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第48-49页 |
| 1.2 主要试剂 | 第49页 |
| 1.3 主要仪器 | 第49页 |
| 2. 方法 | 第49-60页 |
| 2.1 缺失株的构建 | 第49-53页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第49-50页 |
| 2.1.2 融合PCR产物的制备与纯化 | 第50-51页 |
| 2.1.3 感受态细胞的制备及转化 | 第51-52页 |
| 2.1.3.1 感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 2.1.3.2 质粒pKD46的转化 | 第51页 |
| 2.1.3.3 Red重组酶的诱导和感受态细胞的制备 | 第51-52页 |
| 2.1.3.4 电转化 | 第52页 |
| 2.1.4 一次重组株的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| 2.1.5 质粒pKD46的消除 | 第53页 |
| 2.1.6 二次重组和质粒pCP20的消除 | 第53页 |
| 2.1.7 C83902ΔfaeG,C83902ΔmotA,C83902ΔfliCΔfaeG缺失株的构建 | 第53页 |
| 2.2 回补株的构建 | 第53-55页 |
| 2.2.1 回补质粒的构建 | 第53-55页 |
| 2.2.2 回补株的构建 | 第55页 |
| 2.3 FliC多克隆抗体的制备 | 第55-56页 |
| 2.3.1 重组FliC蛋白原核表达引物的设计和载体构建 | 第55页 |
| 2.3.2 重组FliC蛋白的原核表达和纯化 | 第55页 |
| 2.3.3 重组FliC蛋白免疫小鼠 | 第55-56页 |
| 2.3.4 ELISA检测血清效价 | 第56页 |
| 2.3.5 鼠源FliC多抗血清的制备 | 第56页 |
| 2.4 半固体运动试验 | 第56页 |
| 2.5 透射电镜观察 | 第56页 |
| 2.6 玻板凝集试验检测缺失株中FliC和FaeG的表达 | 第56-57页 |
| 2.7 生长试验 | 第57页 |
| 2.8 细胞黏附试验 | 第57-58页 |
| 2.8.1 细胞培养和技术 | 第57页 |
| 2.8.2 细胞黏附试验和黏附抑制试验 | 第57-58页 |
| 2.9 qRT-PCR检测fliC和faeG的表达 | 第58-60页 |
| 2.9.1 待测基因的引物设计 | 第58页 |
| 2.9.2 提取细菌总RNA | 第58页 |
| 2.9.3 去除基因组DNA和反转录cDNA第一链 | 第58-59页 |
| 2.9.4 qRT-PCR | 第59-60页 |
| 2.9.5 数据的分析和处理 | 第60页 |
| 3. 结果 | 第60-70页 |
| 3.1 基因缺失株的构建 | 第60-63页 |
| 3.1.1 融合PCR产物的制备 | 第60-61页 |
| 3.1.2 C83902ΔfliC::Cat 一次重组菌的鉴定 | 第61页 |
| 3.1.3 C83902ΔfliC二次重组菌的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.1.4 C83902ΔfaeG,C83902ΔmotA和C83902ΔfliCΔfaeG二次重组菌的鉴定 | 第62-63页 |
| 3.2 回补质粒的鉴定 | 第63-64页 |
| 3.3 鼠抗FliC多克隆抗体的制备 | 第64-65页 |
| 3.3.1 重组质粒pCold-TF-FliC的鉴定 | 第64页 |
| 3.3.2 重组FliC蛋白的诱导表达和纯化 | 第64-65页 |
| 3.3.3 鼠抗FliC多克隆抗体 | 第65页 |
| 3.4 细菌运动性鉴定 | 第65-67页 |
| 3.5 透射电镜鉴定缺失株 | 第67页 |
| 3.6 玻板凝集鉴定缺失株中FliC和FaeG的表达 | 第67-68页 |
| 3.7 生长试验 | 第68页 |
| 3.8 黏附试验和黏附抑制试验 | 第68-70页 |
| 3.9 qRT-PCR | 第70页 |
| 4. 讨论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-74页 |
| 研究二 K88ac+产肠毒素大肠杆菌鞭毛和K88菌毛对细菌生物被膜及群体感应的影响 | 第74-84页 |
| 1. 材料 | 第75-76页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第75页 |
| 1.2 主要试剂 | 第75-76页 |
| 1.3 主要仪器 | 第76页 |
| 2. 方法 | 第76-77页 |
| 2.1 生物被膜定量试验 | 第76页 |
| 2.2 AI-2分子测定试验 | 第76-77页 |
| 2.3 qRT-PCR | 第77页 |
| 3. 结果 | 第77-79页 |
| 3.1 生物被膜定量试验 | 第77-78页 |
| 3.2 生物发光试验检测AI-2活性 | 第78-79页 |
| 3.3 qRT-PCR | 第79页 |
| 4 讨论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
| 研究三 细胞脂筏在产肠毒素大肠杆菌鞭毛介导的肠上皮细胞促炎性反应中的作用探析 | 第84-99页 |
| 1. 材料 | 第85-86页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第85-86页 |
| 1.2 主要试剂 | 第86页 |
| 1.3 主要仪器 | 第86页 |
| 2. 方法 | 第86-90页 |
| 2.1 重组FliC蛋白的制备 | 第86-87页 |
| 2.1.1 重组FliC蛋白原核表达引物的设计和载体构建 | 第86-87页 |
| 2.1.2 重组FliC蛋白的原核表达和纯化 | 第87页 |
| 2.2 细胞培养及计数 | 第87页 |
| 2.3 MβCD毒性分析 | 第87-88页 |
| 2.3.1 不同浓度MβCD处理对肠上皮细胞的细胞毒性作用分析 | 第87-88页 |
| 2.3.2 不同MβCD处理时间对肠上皮细胞的细胞毒性作用分析 | 第88页 |
| 2.4 膜胆固醇去除效率的鉴定 | 第88页 |
| 2.5 qRT-PCR检测IL-8和TNF-α的表达 | 第88-89页 |
| 2.5.1 待测基因的引物设计 | 第88-89页 |
| 2.5.2 待测样品的准备和qRT-PCR | 第89页 |
| 2.5.3 数据的分析和处理 | 第89页 |
| 2.6 ELISA检测IL-8和TNF-α的表达 | 第89-90页 |
| 2.6.1 待测样品的准备 | 第89页 |
| 2.6.2 ELISA试剂盒检测IL-8和TNF-α表达 | 第89-90页 |
| 3. 结果 | 第90-95页 |
| 3.1 重组FliC蛋白的制备 | 第90-91页 |
| 3.1.1 重组质粒pET28a-FliC的鉴定 | 第90页 |
| 3.1.2 重组FliC蛋白的诱导表达和纯化 | 第90-91页 |
| 3.2 MβCD毒性分析 | 第91-93页 |
| 3.2.1 MβCD去除膜胆固醇最佳作用浓度的选择 | 第91-92页 |
| 3.2.2 MβCD去除膜胆固醇最佳作用时间的选择 | 第92-93页 |
| 3.3 膜胆固醇去除效率的鉴定 | 第93页 |
| 3.4 qRT-PCR检测IL-8和TNF-α的表达 | 第93-94页 |
| 3.5 ELISA检测IL-8和TNF-α的表达 | 第94-95页 |
| 4. 讨论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-99页 |
| 研究四 全基因组测序K88ac+产肠毒素大肠杆菌C83902 | 第99-117页 |
| 1. 材料 | 第100-101页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第100页 |
| 1.2 主要试剂 | 第100-101页 |
| 1.3 主要仪器 | 第101页 |
| 2. 方法 | 第101-102页 |
| 2.1 细菌基因组的提取 | 第101页 |
| 2.2 全基因组测序 | 第101页 |
| 2.3 基因组注释 | 第101-102页 |
| 2.4 其他基因元件的预测 | 第102页 |
| 2.5 系统进化树的构建 | 第102页 |
| 3. 结果 | 第102-110页 |
| 3.1 基因组组装评价 | 第102页 |
| 3.2 C83902基因组的基本特征 | 第102-104页 |
| 3.3 基因组功能注释 | 第104-105页 |
| 3.3.1 KEGG注释 | 第104页 |
| 3.3.2 COG数据库注释 | 第104-105页 |
| 3.4 CRISPR分析 | 第105-106页 |
| 3.5 前噬菌体分析 | 第106-107页 |
| 3.6 耐药基因检测 | 第107-108页 |
| 3.7 系统进化树 | 第108页 |
| 3.8 毒力因子预测和新型菌毛的发现 | 第108-110页 |
| 4. 讨论 | 第110-113页 |
| 参考文献 | 第113-117页 |
| 研究五 K88ac+产肠毒素大肠杆菌alpha菌毛的克隆、表达和鉴定 | 第117-127页 |
| 1. 材料 | 第118-119页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第118页 |
| 1.2 主要试剂 | 第118页 |
| 1.3 主要仪器 | 第118-119页 |
| 2. 方法 | 第119-121页 |
| 2.1 操纵子的预测和分布调查 | 第119页 |
| 2.2 表达载体的构建 | 第119-120页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第119-120页 |
| 2.2.2 表达载体的构建 | 第120页 |
| 2.3 透射电镜鉴定Alpha菌毛 | 第120页 |
| 2.4 细胞黏附试验 | 第120-121页 |
| 3. 结果 | 第121-125页 |
| 3.1 Alpha菌毛操纵子的特征与分布 | 第121-123页 |
| 3.2 Alpha菌毛表达载体的构建 | 第123页 |
| 3.3 透射电镜观察alpha菌毛表达 | 第123-125页 |
| 4. 讨论 | 第125页 |
| 参考文献 | 第125-127页 |
| 全文结论 | 第127-129页 |
| 论文创新点 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-132页 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 | 第132-136页 |
