| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 马铃薯Y病毒 | 第10页 |
| 1.2 真核翻译起始因子 4E | 第10-13页 |
| 1.2.1 真核翻译起始因子eiF4E的结构 | 第10-11页 |
| 1.2.2 真核翻译起始因子eIF4E的功能 | 第11页 |
| 1.2.3 翻译起始因子eIF4E在病毒侵染过程中的作用 | 第11-13页 |
| 1.3 CRISPR/Cas体系的研究背景 | 第13-19页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的结构 | 第14-15页 |
| 1.3.2 CRISPR系统的三个主要类型及作用机理 | 第15-17页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas系统在植物中的应用及存在的问题 | 第17-19页 |
| 1.4 本研究的意义 | 第19页 |
| 1.5 技术路线 | 第19-20页 |
| 1.6 实施方案 | 第20-21页 |
| 第2章 靶向eIF4E-6 基因CRISPR-Cas9载体的构建 | 第21-30页 |
| 2.1 材料、仪器和试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.1 供试材料 | 第21页 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 | 第21页 |
| 2.1.3 主要试剂与耗材 | 第21-22页 |
| 2.2 试验方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 筛选PVY侵染相关的eIF4E家族成员 | 第22页 |
| 2.2.2 eIF4E-6 基因的敲除载体 | 第22-23页 |
| 2.2.3 热激转化 | 第23-24页 |
| 2.2.4 热激转化阳性单克隆验证 | 第24-25页 |
| 2.2.5 含有Cas9gRNA(1＆2)大肠杆菌质粒提取 | 第25-26页 |
| 2.2.6 工程菌的制备 | 第26页 |
| 2.3 结与果分析 | 第26-29页 |
| 2.3.1 候选基因的确定 | 第26-27页 |
| 2.3.2 表达载体的构建及鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.3 工程菌的制备 | 第28-29页 |
| 2.4 本章小结 | 第29-30页 |
| 第3章 Cas9体外酶切检测 | 第30-37页 |
| 3.1 实验试剂、仪器 | 第30页 |
| 3.1.1 实验所耗试剂 | 第30页 |
| 3.1.2 实验所需仪器 | 第30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-34页 |
| 3.2.1 gRNA体外转录DNA模板的制备 | 第30-32页 |
| 3.2.2 gRNA体外转录 | 第32-33页 |
| 3.2.3 小片段gRNA的抽提 | 第33页 |
| 3.2.4 Cas9体外酶切检测 | 第33-34页 |
| 3.3 结果与分析 | 第34-35页 |
| 3.3.1 DNA模板的制备 | 第34-35页 |
| 3.3.2 Cas9体外酶切检测 | 第35页 |
| 3.4 本章小结 | 第35-37页 |
| 第4章 Cas9 /gRNA敲除体系在烟草基因组定点修饰 | 第37-50页 |
| 4.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第37页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第37页 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 | 第37页 |
| 4.1.4 主要培养基 | 第37-38页 |
| 4.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第38-39页 |
| 4.2.1 工程菌的活化 | 第38页 |
| 4.2.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第38-39页 |
| 4.3 利用Cas9/gRNA敲除载体的潮霉素抗性鉴定转化株 | 第39-42页 |
| 4.3.1 烟草K326转化株的DNA提取 | 第39-40页 |
| 4.3.2 g1＆g2RNA两个靶点阳性转化株PCR鉴定 | 第40页 |
| 4.3.3 T0代K326烟株eIF4E-6 基因突变检测 | 第40-42页 |
| 4.4 生物信息学筛选突变株 | 第42页 |
| 4.5 结果与分析 | 第42-48页 |
| 4.5.1 抗性苗的获得 | 第42-43页 |
| 4.5.2 g1＆g2RNA两个靶点阳性转化株PCR鉴定 | 第43-44页 |
| 4.5.3 T0代K326烟株eIF4E-6 基因突变检测 | 第44-48页 |
| 4.6 本章小结 | 第48-50页 |
| 第5章 K326烟草体内eIF4E-6 和PVY基因的表达规律研究 | 第50-59页 |
| 5.1 材料与方法 | 第50页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第50页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 | 第50页 |
| 5.2 试验方法 | 第50-55页 |
| 5.2.1 RT-PCR引物设计 | 第50-51页 |
| 5.2.2 烟草植物基因组总RNA提取 | 第51-52页 |
| 5.2.3 eIF4E-6 和PVY基因定量引物筛选 | 第52-53页 |
| 5.2.4 烟草普通PVY病毒接种 | 第53-54页 |
| 5.2.5 RT-PCR | 第54页 |
| 5.2.6 PVY抗性鉴定 | 第54-55页 |
| 5.3 结果与分析 | 第55-58页 |
| 5.3.1 eIF4E-6 和PVY基因定量引物筛选结果 | 第55-56页 |
| 5.3.2 突变株eIF4E-6 基因的RT-PCR结果分析 | 第56-57页 |
| 5.3.3 突变株PVY病毒量的RT-PCR结果分析 | 第57页 |
| 5.3.4 突变株的生物学性状 | 第57-58页 |
| 5.4 本章小结 | 第58-59页 |
| 讨论 | 第59-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-71页 |
| 附录 | 第71-75页 |
| 附录1 载体测序 | 第71-74页 |
| 附录2 引物序列 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第76页 |
