| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 引言 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-30页 |
| 1.1 脂肪酶简介 | 第10-13页 |
| 1.1.1 脂肪酶及其来源 | 第10-11页 |
| 1.1.2 脂肪酶的催化特性 | 第11-12页 |
| 1.1.3 脂肪酶的催化机理 | 第12-13页 |
| 1.2 脂肪酶的应用 | 第13-15页 |
| 1.2.1 食品工业 | 第13-14页 |
| 1.2.2 制药工业 | 第14页 |
| 1.2.3 洗涤剂工业 | 第14-15页 |
| 1.2.4 生物柴油的制备 | 第15页 |
| 1.3 蛋白质工程在脂肪酶改造中的应用 | 第15-21页 |
| 1.3.1 提高热稳定性 | 第17-18页 |
| 1.3.2 改变不同链长脂肪酸的选择性 | 第18页 |
| 1.3.3 提高反式脂肪酸选择性 | 第18-19页 |
| 1.3.4 提高抗氧化性 | 第19页 |
| 1.3.5 提高酶活 | 第19页 |
| 1.3.6 立体选择性 | 第19-20页 |
| 1.3.7 提高甲醇耐受性 | 第20页 |
| 1.3.8 提高表面活性剂耐受性 | 第20-21页 |
| 1.4 定向进化的实验手段 | 第21-27页 |
| 1.4.1 突变库的构建方法 | 第21-24页 |
| 1.4.2 定向进化的筛选策略 | 第24-27页 |
| 1.4.3 定点突变的方法 | 第27页 |
| 1.5 毕赤酵母表达系统简介 | 第27-28页 |
| 1.6 本课题的研究内容 | 第28-30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-34页 |
| 2.1.1 基因、质粒与菌株 | 第30页 |
| 2.1.2 PCR引物列表 | 第30-32页 |
| 2.1.3 工具酶与试剂盒 | 第32页 |
| 2.1.4 主要实验仪器 | 第32页 |
| 2.1.5 主要生化试剂 | 第32-33页 |
| 2.1.6 培养基与主要溶液 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-44页 |
| 2.2.1 确定易错PCR条件 | 第34页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| 2.2.3 PCR产物胶回收 | 第34-35页 |
| 2.2.4 PCR产物和质粒的双酶切 | 第35页 |
| 2.2.5 PCR产物和质粒的连接 | 第35-36页 |
| 2.2.6 大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.2.7 重组质粒的转化 | 第36页 |
| 2.2.8 质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.9 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.2.10 重组质粒的酵母转化 | 第37页 |
| 2.2.11 构建突变库 | 第37-38页 |
| 2.2.12 初步筛选突变菌株 | 第38页 |
| 2.2.13 平板法筛选耐甲醇突变株 | 第38-39页 |
| 2.2.14 重组酵母的发酵 | 第39页 |
| 2.2.15 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第39页 |
| 2.2.16 脂肪酶酶活测定方法 | 第39-40页 |
| 2.2.17 筛选耐甲醇酶液 | 第40页 |
| 2.2.18 测定酶的甲醇耐受性 | 第40-41页 |
| 2.2.19 测定酶的表面活性剂耐受性 | 第41页 |
| 2.2.20 测定其他酶学性质 | 第41-42页 |
| 2.2.21 获取突变菌株基因并测序 | 第42页 |
| 2.2.22 定点饱和突变 | 第42-44页 |
| 3 实验结果 | 第44-58页 |
| 3.1 易错PCR条件的确定 | 第44页 |
| 3.2 突变库的构建与初步筛选 | 第44-46页 |
| 3.3 耐甲醇突变株筛选结果 | 第46页 |
| 3.4 突变脂肪酶 | 第46-49页 |
| 3.4.1 甲醇耐受性 | 第47页 |
| 3.4.2 序列分析 | 第47-49页 |
| 3.4.3 其他酶学性质 | 第49页 |
| 3.5 突变脂肪酶 | 第49-58页 |
| 3.5.1 SDS耐受性 | 第49-51页 |
| 3.5.2 突变株对其他表面活性剂的耐受性 | 第51-53页 |
| 3.5.3 其他酶学性质 | 第53-54页 |
| 3.5.4 突变序列分析 | 第54-55页 |
| 3.5.5 饱和突变实验结果 | 第55-58页 |
| 4 讨论与展望 | 第58-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 附录A 枝孢霉脂肪酶基因序列 | 第68-69页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |