| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-25页 |
| 1.1 蛇毒概述 | 第12页 |
| 1.2 磷脂酶A_2的研究 | 第12-17页 |
| 1.2.1 磷脂酶A_2概述 | 第12-13页 |
| 1.2.2 磷脂酶A_2的分类 | 第13-14页 |
| 1.2.3 sPLA_2的结构特征 | 第14-16页 |
| 1.2.4 sPLA_2的催化机理 | 第16-17页 |
| 1.3 蛇毒磷脂酶A_2的研究 | 第17-23页 |
| 1.3.1 蛇毒磷脂酶A_2的分类 | 第17-19页 |
| 1.3.2 蛇毒磷脂酶A_2的结构特征 | 第19-20页 |
| 1.3.3 蛇毒磷脂酶A_2结构与功能的研究 | 第20-22页 |
| 1.3.4 蛇毒磷脂酶A_2的药理学性质 | 第22-23页 |
| 1.4 本研究的选题依据及研究内容 | 第23-25页 |
| 2 Gln49-PLA_2及突变体基因杆状病毒表达载体的构建、筛选与转化 | 第25-39页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第26-28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-35页 |
| 2.3.1 蛇毒Gln49-PLA_2及突变体Asp49-PLA_2基因的克隆 | 第28-30页 |
| 2.3.2 Gln49-PLA_2及突变体基因重组供体质粒的构建 | 第30-33页 |
| 2.3.3 Gln49-PLA_2及突变体基因重组穿梭杆粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.4 重组杆状病毒的制备 | 第34-35页 |
| 2.4 实验结果 | 第35-38页 |
| 2.4.1 Gln49-PLA_2及突变体基因的PCR扩增 | 第35页 |
| 2.4.2 Gln49-PLA_2及其突变体基因供体质粒的构建及鉴定 | 第35-36页 |
| 2.4.3 重组杆粒Bacmid-EGFP-Gln49/Asp49-PLA_2的PCR鉴定 | 第36页 |
| 2.4.4 重组杆粒Bacmid-EGFP-Gln49/Asp49-PLA_2的转染 | 第36-38页 |
| 2.5 讨论 | 第38页 |
| 2.6 小结 | 第38-39页 |
| 3 Gln49-PLA_2及突变体基因的表达与纯化 | 第39-58页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39-40页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第39页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.3 实验试剂 | 第40页 |
| 3.3 实验方法 | 第40-45页 |
| 3.3.1 重组Gln49-PLA_2及突变体基因在昆虫细胞中的表达 | 第40页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE检测重组Gln49-PLA_2及Asp49-PLA_2蛋白的表达 | 第40-42页 |
| 3.3.3 昆虫细胞表达重组蛋白加入病毒量的优化 | 第42页 |
| 3.3.4 昆虫细胞表达重组蛋白感染时间的优化 | 第42页 |
| 3.3.5 重组Gln49-PLA_2及Asp49-PLA_2蛋白纯化前处理 | 第42-43页 |
| 3.3.6 重组Gln49-PLA_2及Asp49-PLA_2蛋白的分离纯化 | 第43页 |
| 3.3.7 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 | 第43-44页 |
| 3.3.8 重组Gln49-PLA_2及Asp49-PLA_2蛋白纯化后的质谱鉴定 | 第44-45页 |
| 3.3.9 重组表达蛋白对纤维蛋白原的降解 | 第45页 |
| 3.3.10 重组表达蛋白的磷脂酶水解活性测定 | 第45页 |
| 3.4 实验结果 | 第45-55页 |
| 3.4.1 重组Gln49-PLA_2及其突变体基因在昆虫细胞中的表达 | 第45页 |
| 3.4.2 昆虫细胞表达重组蛋白加入病毒量的优化 | 第45-47页 |
| 3.4.3 昆虫细胞表达重组蛋白感染时间的优化 | 第47页 |
| 3.4.4 重组表达Gln49-PLA_2蛋白的分离纯化及质谱鉴定 | 第47-52页 |
| 3.4.5 重组表达Asp49-PLA_2蛋白的分离纯化及质谱鉴定 | 第52-54页 |
| 3.4.6 重组表达蛋白的定量 | 第54页 |
| 3.4.7 重组表达蛋白对纤维蛋白原的降解 | 第54-55页 |
| 3.4.8 重组表达蛋白的磷脂酶水解活性测定 | 第55页 |
| 3.5 讨论 | 第55-57页 |
| 3.6 小结 | 第57-58页 |
| 4 Asp49-PLA_2基因的大肠杆菌无细胞合成体系重组表达 | 第58-72页 |
| 4.1 引言 | 第58页 |
| 4.2 实验材料、试剂和仪器 | 第58-62页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第58-59页 |
| 4.2.2 实验试剂 | 第59-62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-67页 |
| 4.3.1 Asp49-PLA_2基因片段的克隆 | 第62-63页 |
| 4.3.2 pET21b(+)-Asp49-PLA_2载体的构建 | 第63-65页 |
| 4.3.3 pET21b(+)-Asp49-PLA_2载体的大肠杆菌无细胞合成体系表达 | 第65-66页 |
| 4.3.4 无细胞体系表达Asp49-PLA_2蛋白的分离纯化及酶学性质鉴定 | 第66-67页 |
| 4.4 实验结果 | 第67-70页 |
| 4.4.1 PCR扩增Asp49-PLA_2基因片段 | 第67-68页 |
| 4.4.2 pET21b(+)-Asp49-PLA_2重组载体的构建与鉴定 | 第68页 |
| 4.4.3 Asp49-PLA_2蛋白的无细胞体系表达及分离纯化 | 第68-69页 |
| 4.4.4 Asp49-PLA_2蛋白的定量及磷脂酶活性测定 | 第69-70页 |
| 4.5 讨论 | 第70-71页 |
| 4.6 小结 | 第71-72页 |
| 结论与展望 | 第72-73页 |
| 结论 | 第72页 |
| 展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 附录A缩略语表及名称说明 | 第79-81页 |
| 附录B-Ⅰ pFastBac~(TM) Dual质粒图谱 | 第81-82页 |
| 附录B-Ⅱ pET21b(+)质粒图谱 | 第82-83页 |
| 附录C-Ⅰ pFastBac~(TM) Dual-Gln49-PLA_2测序结果 | 第83-85页 |
| 附录C-Ⅱ pFastBac~(TM) Dual-Asp49-PLA_2测序结果 | 第85-87页 |
| 附录C-Ⅲ pET21b(+)-Asp49-PLA_2测序结果 | 第87-89页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
