| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 1 前言 | 第11-14页 |
| 2 实验材料与试剂 | 第14-22页 |
| 2.1 实验材料 | 第14页 |
| 2.2 主要试剂、酶类 | 第14-16页 |
| 2.3 菌株和质粒 | 第16页 |
| 2.4 主要试剂配制 | 第16-19页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2.6 计算机软件及数据库 | 第20-22页 |
| 3 实验方法 | 第22-32页 |
| 3.1 Bs-TpNPPase的序列分析 | 第22页 |
| 3.1.1 Bs-TpNPPase 的序列分析 | 第22页 |
| 3.1.2 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第22页 |
| 3.2 Bs-TpNPPase融合蛋白的表达与纯化 | 第22-24页 |
| 3.2.1 Bs-TpNPPase融合蛋白的表达 | 第22页 |
| 3.2.2 Bs-TpNPPase融合蛋白的纯化 | 第22-23页 |
| 3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶配制方法 | 第23页 |
| 3.2.4 超滤操作方法 | 第23页 |
| 3.2.5 纯化蛋白溶液浓度的测定 | 第23-24页 |
| 3.3 Bs-TpNPPase的磷酸酶活性测定 | 第24-25页 |
| 3.3.1 Bs-TpNPPase最适反应温度和测定 | 第24页 |
| 3.3.2 Bs-TpNPPase的热稳定性测定 | 第24页 |
| 3.3.3 Bs-TpNPPasepH稳定性测定 | 第24-25页 |
| 3.4 结晶Bs-TpNPPase的表达纯化 | 第25页 |
| 3.5 Bs-TpNPPase蛋白结晶条件的筛选和优化 | 第25页 |
| 3.5.1 Bs-TpNPPase蛋白结晶条件的筛选 | 第25页 |
| 3.5.2 Bs-TpNPPase蛋白结晶条件的优化 | 第25页 |
| 3.6 衍射数据收集和结构解析 | 第25-26页 |
| 3.6.1 防冻剂筛选 | 第25-26页 |
| 3.6.2 X-射线衍射数据的收集 | 第26页 |
| 3.6.3 Bs-TpNPPase的结构解析 | 第26页 |
| 3.7 Bs-TpNPPase的随机突变和定向进化 | 第26-32页 |
| 3.7.1 随机突变易错PCR | 第26-27页 |
| 3.7.2 随机突变文库的构建和热稳定升高突变体的筛选 | 第27-30页 |
| 3.7.3 突变体的表达纯化 | 第30页 |
| 3.7.4 突变体的酶活力测定 | 第30页 |
| 3.7.5 突变体的酶学性质 | 第30-31页 |
| 3.7.6 结晶用突变体Bs-TpNPPase的表达纯化 | 第31页 |
| 3.7.7 突变体Bs-TpNPPase蛋白的结晶条件的筛选和优化 | 第31页 |
| 3.7.8 突变体Bs-TpNPPase蛋白衍射数据收集和结构解析 | 第31-32页 |
| 4 结果和讨论 | 第32-102页 |
| 4.1 Bs-TpNPPase的表达纯化与活性检测 | 第32-37页 |
| 4.1.1 Bs-TpNPPase的序列分析 | 第32-33页 |
| 4.1.2 Bs-TpNPPase的表达纯化 | 第33-34页 |
| 4.1.3 Bs-TpNPPase的活性测定 | 第34-37页 |
| 4.2 Bs-TpNPPase的结构解析 | 第37-46页 |
| 4.2.1 Bs-TpNPPase的晶体制备 | 第37-40页 |
| 4.2.2 衍射数据收集 | 第40-41页 |
| 4.2.3 野生型Bs-TpNPPase的晶体结构解析 | 第41-42页 |
| 4.2.4 Bs-TpNPPase模型质量分析 | 第42-46页 |
| 4.3 Bs-TpNPPase的结构分析 | 第46-73页 |
| 4.3.1 Bs-TpNPPase的晶体结构分析 | 第46-53页 |
| 4.3.2 Bs-TpNPPase催化机制的分析 | 第53-59页 |
| 4.3.3 Bs-TpNPPase耐热机制分析 | 第59-73页 |
| 4.4 Bs-TpNPPase热稳定性的定向进化 | 第73-91页 |
| 4.4.1 筛选热稳定性增强的Bs-TpNPPase突变体 | 第73-74页 |
| 4.4.2 突变体的活性检测 | 第74-91页 |
| 4.5 A150V、A150V/F157L突变体Bs-TpNPPase的结构解析 | 第91-102页 |
| 4.5.1 A150V、A150V/F157L突变体Bs-TpNPPase的晶体制备 | 第91-95页 |
| 4.5.2 衍射数据收集 | 第95页 |
| 4.5.3 A150V、A150V/F157L突变体Bs-TpNPPase晶体结构解析 | 第95-96页 |
| 4.5.4 A150V、A150V/F157L突变体晶体结构质量分析 | 第96-99页 |
| 4.5.5 A150V、A150V/F157L突变体与野生型Bs-TpNPPase的蛋白分子内相互作用及空间结构对比 | 第99-102页 |
| 总结 | 第102-103页 |
| 展望 | 第103-104页 |
| 综述 | 第104-111页 |
| 参考文献 | 第111-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
