| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 研究综述 | 第13-27页 |
| 1 登革热病毒 | 第13-16页 |
| 1.1 登革病毒基因组成 | 第13-14页 |
| 1.2 登革病毒感染细胞与胞内复制 | 第14-16页 |
| 1.3 登革病毒结构多样性 | 第16页 |
| 2 重症登革热与登革病毒抗体依赖增强感染 | 第16-19页 |
| 2.1 重症登革热临床表现 | 第16-17页 |
| 2.2 重症登革热病理机制研究 | 第17-19页 |
| 2.2.1 登革热病毒抗体依赖增强感染假说 | 第17-18页 |
| 2.2.2 细胞免疫与细胞因子在重症登革热感染中的作用 | 第18-19页 |
| 3 细胞固有免疫与登革病毒感染中的免疫逃逸机制 | 第19-23页 |
| 3.1 细胞固有免疫的组成与功能 | 第19-20页 |
| 3.2 登革病毒直接感染对固有免疫系统的抑制 | 第20-21页 |
| 3.3 登革病毒抗体依赖增强感染中的免疫逃逸机制 | 第21-23页 |
| 4 细胞自噬与登革病毒感染 | 第23-26页 |
| 4.1 细胞自噬与调控 | 第23-24页 |
| 4.2 自噬与固有免疫及适应性免疫的关系 | 第24-25页 |
| 4.3 登革热病毒感染中细胞自噬的意义 | 第25-26页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第26-27页 |
| 第二章 登革热病毒抗体依赖增强感染体外模型的建立 | 第27-53页 |
| 1 前言 | 第27页 |
| 2 实验材料与仪器 | 第27-29页 |
| 2.1 细胞株、临床血液样品和抗体等 | 第27-28页 |
| 2.2 主要商品化溶液,生化试剂及试剂盒 | 第28-29页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第29页 |
| 3 研究方法与步骤 | 第29-42页 |
| 3.1 C6/36细胞分离人血清中登革热病毒 | 第29-30页 |
| 3.2 基于RT-PCR的登革热病毒核酸检测 | 第30-32页 |
| 3.2.1 提取病毒RNA | 第30页 |
| 3.2.2 病毒RT-PCR鉴定 | 第30-32页 |
| 3.3 病毒噬斑纯化及传代培养 | 第32-36页 |
| 3.3.1 病毒噬斑纯化 | 第32-33页 |
| 3.3.2 病毒扩大培养与毒种保存 | 第33页 |
| 3.3.3 纯化毒种的全基因测序鉴定 | 第33-36页 |
| 3.4 登革热病毒SYBR法绝对定量体系建立 | 第36-39页 |
| 3.5 不同单克隆抗体对登革热病毒的亲和力及中和能力检测 | 第39-40页 |
| 3.5.1 不同单克隆抗体对DENV3亲和力的ELISA检测 | 第39-40页 |
| 3.5.2 不同单克隆抗体对DENV3中和能力检测 | 第40页 |
| 3.6 K562细胞系的登革热病毒抗体依赖增强模型建立 | 第40-42页 |
| 4 结果与分析 | 第42-51页 |
| 4.1 登革热临床血液样品中病毒的分离与鉴定 | 第42-44页 |
| 4.2 登革热病毒荧光定量PCR检测体系建立 | 第44-48页 |
| 4.3 不同抗体对登革热病毒的亲和力和中和活性测定 | 第48-49页 |
| 4.4 基于K562细胞株的DENV3抗体依赖增强模型 | 第49-51页 |
| 5 讨论 | 第51-53页 |
| 第三章 登革热病毒ADE感染抑制细胞天然免疫相关途径 | 第53-81页 |
| 1 前言 | 第53页 |
| 2 实验材料与仪器 | 第53-55页 |
| 2.1 细胞株,大肠杆菌菌株,培养基及质粒 | 第53-54页 |
| 2.2 主要生化试剂和试剂盒 | 第54-55页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第55页 |
| 3 研究方法与步骤 | 第55-67页 |
| 3.1 DENV直接感染与抗体依赖增强感染中病毒增殖动力研究 | 第55-57页 |
| 3.2 DENV-ADE感染中增强抗体对病毒颗粒吸附和内吞的绝对定量 | 第57-58页 |
| 3.3 登革热抗体依赖增强感染模型中细胞内NO含量检测 | 第58-59页 |
| 3.4 NOS2抑制剂处理K562细胞 | 第59页 |
| 3.5 药物对K562细胞活性影响的MTT检测 | 第59页 |
| 3.6 抗体依赖增强感染模型中固有免疫相关基因的转录水平检测 | 第59-60页 |
| 3.7 抗体依赖增强感染模型中固有免疫相关基因的蛋白水平检测 | 第60-63页 |
| 3.7.1 SDS-PAGE分离细胞总蛋白 | 第60-61页 |
| 3.7.2 Western-Blot检测蛋白相对表达量 | 第61-62页 |
| 3.7.3 结果统计与分析方法 | 第62-63页 |
| 3.8 RIG-I和MDA-5基因过表达质粒构建 | 第63-66页 |
| 3.8.1 RIG-I和MDA-5全长基因扩增 | 第63-64页 |
| 3.8.2 全长基因PCR产物胶回收纯化 | 第64页 |
| 3.8.3 平末端T载体连接与转化 | 第64-65页 |
| 3.8.4 酶切、连接和转化 | 第65页 |
| 3.8.5 无内毒素表达质粒大规模制备 | 第65-66页 |
| 3.9 RIG-I和MDA-5过表达质粒转染K562细胞 | 第66-67页 |
| 4 实验结果与分析 | 第67-77页 |
| 4.1 细胞DENv-ADE模型中病毒产量增加不仅与胞外ADE作用有关 | 第67-68页 |
| 4.2 K562细胞抗体依赖增强感染依赖于NOS2基因表达抑制 | 第68-71页 |
| 4.3 K562细胞抗体依赖增强感染抑制RIG-I/MDA-5信号通路 | 第71-75页 |
| 4.4 人源RIG-I和MDA-5过表达质粒构建 | 第75页 |
| 4.5 RIG-I/MDA-5通过抑制NF-κB激活和NOS2表达来削弱DENV-ADE效应 | 第75-77页 |
| 5 讨论 | 第77-81页 |
| 第四章 登革热病毒抑制细胞固有免疫途径不依赖于Ⅰ型干扰素和IL-10的作用 | 第81-105页 |
| 1 前言 | 第81页 |
| 2 实验材料与仪器 | 第81-83页 |
| 2.1 哺乳动物细胞株,溶液及培养基 | 第81-82页 |
| 2.2 主要生化试剂和试剂盒 | 第82页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第82-83页 |
| 3 研究方法与步骤 | 第83-92页 |
| 3.1 K562细胞缺乏Ⅰ型干扰素的PCR鉴定 | 第83-84页 |
| 3.2 Dot-Blot检测K562细胞中Ⅰ型干扰素基因缺失 | 第84-85页 |
| 3.2.1 生物素随机引物DNA标记 | 第84页 |
| 3.2.2 基因组DNA点膜和交联 | 第84页 |
| 3.2.3 样品预杂交,杂交,洗膜 | 第84-85页 |
| 3.2.4 化学发光法生物素标记核酸检测 | 第85页 |
| 3.3 双荧光素酶报告基因检测 | 第85-86页 |
| 3.4 DENV-ADE过程中IL-10、SOCS3、1L-6和SOCS1的转录水平检测 | 第86-87页 |
| 3.5 登革热抗体依赖增强感染中IL-10的ELISA检测 | 第87-88页 |
| 3.6 Crispr-Cas9敲除K562细胞IL-10基因 | 第88-92页 |
| 3.6.1 Crispr-Cas9敲除IL-10基因靶点设计 | 第88页 |
| 3.6.2 Human IL-10敲除Px330质粒构建 | 第88-90页 |
| 3.6.3 K562细胞IL-10敲除的基因水平PCR验证 | 第90-91页 |
| 3.6.4 K562IL-10-/-双倍型敲除株单细胞系筛选与测序验证 | 第91-92页 |
| 4 实验结果与分析 | 第92-102页 |
| 4.1 K562细胞Ⅰ型干扰素基因缺陷鉴定 | 第92-93页 |
| 4.2 双荧光素酶报告基因法检测DENV-ADE中Ⅰ型干扰素基因的启动 | 第93-94页 |
| 4.3 荧光定量PCR检测DENV/DENV-ADE感染中IFN-γ转录水平 | 第94-95页 |
| 4.4 DENV-ADE感染K562细胞未上调IL-10相关信号通路 | 第95-97页 |
| 4.5 IL-10敲除的K562细胞具备完全的抗体依赖增强能力 | 第97-102页 |
| 4.5.1 基于Cripsr-cas9敲除的IL-10基因靶点设计 | 第97-98页 |
| 4.5.2 sgRNA oligo退火连接载体与鉴定 | 第98-99页 |
| 4.5.3 K562细胞IL-10敲除的基因水平PCR验证 | 第99-100页 |
| 4.5.4 IL-10基因敲除的K562单克隆细胞系筛选鉴定 | 第100-101页 |
| 4.5.5 IL-10基因敲除的K562细胞不影响DENV-ADE感染 | 第101-102页 |
| 5 讨论 | 第102-105页 |
| 第五章 登革热病毒抗体依赖增强感染K562细胞通过促进细胞自噬过程从而促进病毒增殖 | 第105-125页 |
| 2 前言 | 第105-107页 |
| 2.1 细胞株,大肠杆菌菌株,培养基及质粒 | 第106-107页 |
| 2.2 主要生化试剂和试剂盒 | 第107页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第107页 |
| 3 研究方法与步骤 | 第107-112页 |
| 3.1 DENV/DENV-ADE感染K562细胞中自噬过程检测 | 第107-108页 |
| 3.1.1 荧光定量PCR检测自噬相关基因ATG5,ATG12转录水平 | 第107-108页 |
| 3.1.2 DENV/DENV-ADE感染K562细胞过程中自噬标志LC3Ⅱ蛋白水平检测 | 第108页 |
| 3.2 自噬促进剂和自噬抑制剂对于DENV增强影响 | 第108-109页 |
| 3.1.2 Rapamycine和3-MA预处理K562细胞 | 第108-109页 |
| 3.1.3 MTT检测检测K562细胞活性 | 第109页 |
| 3.3 基于Crispr-cas9方法敲除K562自噬相关基因ATG5 | 第109-111页 |
| 3.3.1 ATG5基因敲除靶点设计 | 第109页 |
| 3.3.2 sgRNA上下链合成与px330载体连接 | 第109-110页 |
| 3.3.3 Human ATG5敲除Px330质粒构建 | 第110页 |
| 3.3.4 K562细胞ATG5基因敲除的基因水平检测 | 第110-111页 |
| 3.3.5 K562 ATG5-/-双倍型敲除株单细胞系筛选与测序验证 | 第111页 |
| 3.3.6 ATG5敲除K562细胞进行DENV/DENV-ADE感染 | 第111页 |
| 3.4 K562细胞过表达ATG5抑制登革病毒感染中固有免疫 | 第111-112页 |
| 4 实验结果与分析 | 第112-122页 |
| 4.1 DENV/DENV-ADE感染K562细胞中自噬过程检测 | 第112-114页 |
| 4.1.1 登革病毒抗体依赖增强感染促进早期自噬相关基因转录 | 第112-114页 |
| 4.1.2 登革病毒抗体依赖增强感染K562细胞自噬体形成 | 第114页 |
| 4.2 自噬促进剂和自噬抑制剂对于DENV胞内复制的影响 | 第114-117页 |
| 4.3 ATG5敲除K562细胞抑制登革病毒抗体依赖增强感染 | 第117-120页 |
| 4.3.1 基于Cripsr-cas9敲除的ATG5基因靶点设计 | 第117页 |
| 4.3.2 K562细胞ATG5敲除的基因水平PCR验证 | 第117-118页 |
| 4.3.3 ATG5基因敲除的K562单克隆细胞系筛选鉴定 | 第118-119页 |
| 4.3.4 ATG5基因敲除K562细胞抑制登革热病毒感染 | 第119-120页 |
| 4.4 过表达ATG5促进DENV胞内复制 | 第120-122页 |
| 5 讨论 | 第122-125页 |
| 全文总结 | 第125-129页 |
| 参考文献 | 第129-139页 |
| 附录 | 第139-157页 |
| 致谢 | 第157-159页 |
| 个人简历 | 第159-161页 |
