| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.1 蛋白酶 | 第13页 |
| 1.1.1 蛋白酶概述及分类 | 第13页 |
| 1.2 沙雷氏蛋白酶 | 第13-16页 |
| 1.2.1 沙雷氏蛋白酶及其抑制剂 | 第13-15页 |
| 1.2.2 低温碱性蛋白酶MP | 第15-16页 |
| 1.3 蛋白纯化方法 | 第16-19页 |
| 1.3.1 沉淀法 | 第16-17页 |
| 1.3.2 层析法 | 第17-18页 |
| 1.3.3 膜超滤法 | 第18-19页 |
| 1.4 蛋白质晶体学 | 第19-22页 |
| 1.4.1 蛋白质晶体学概述 | 第19页 |
| 1.4.2 蛋白质结晶技术 | 第19-21页 |
| 1.4.3 沙雷氏蛋白酶及其抑制剂复合体的晶体结构研究 | 第21-22页 |
| 1.5 本实验的立题依据及主要研究内容 | 第22-24页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第22-23页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第23-24页 |
| 第二章 pET28a-lupI-MSSS原核表达载体的构建 | 第24-31页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第25页 |
| 2.1.3 培养基和试剂配置 | 第25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-28页 |
| 2.2.1 PCR扩增基因片段 | 第25-26页 |
| 2.2.2 PCR结果观察 | 第26页 |
| 2.2.3 PCR产物的胶回收 | 第26-27页 |
| 2.2.4 空白质粒的提取与酶切 | 第27页 |
| 2.2.5 PCR回收产物与载体连接、转化 | 第27页 |
| 2.2.6 阳性重组子的鉴定 | 第27页 |
| 2.2.7 抑制剂LupI-MSSS在大肠杆菌中的表达步骤 | 第27-28页 |
| 2.3 试验结果 | 第28-30页 |
| 2.3.1 抑制剂LupI-MSSS原核表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 2.3.2 抑制剂LupI-MSSS诱导表达结果 | 第29-30页 |
| 2.4 本章小结 | 第30-31页 |
| 第三章 LupI-MSSS在大肠杆菌中的表达及表达条件优化 | 第31-47页 |
| 3.1 材料与方法 | 第31-32页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第31页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第31-32页 |
| 3.2 分析方法 | 第32-34页 |
| 3.2.1 抑制剂活性测定 | 第32页 |
| 3.2.2 抑制剂LupI-MSSS表达条件优化单因素试验 | 第32-33页 |
| 3.2.2.1 培养基初始pH对LupI-MSSS产量的影响 | 第32-33页 |
| 3.2.2.2 接种量对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.2.3 诱导剂添加时间对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.2.4 诱导剂浓度对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.2.5 诱导温度对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.2.6 诱导时间对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.2.7 摇床转速对LupI-MSSS产量的影响 | 第33页 |
| 3.2.3 响应面法优化LupI-MSSS表达条件 | 第33-34页 |
| 3.2.3.1 用Plackett-Burman试验筛选主要影响因子 | 第33-34页 |
| 3.2.3.2 利用Box-Behnken响应面设计确定最佳配方 | 第34页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第34-46页 |
| 3.3.1 单因素法优化LupI-MSSS表达条件 | 第34-42页 |
| 3.3.1.1 培养基初始pH对LupI-MSSS产量的影响 | 第34-35页 |
| 3.3.1.2 接种量对LupI-MSSS产量的影响 | 第35-36页 |
| 3.3.1.3 诱导剂添加时间对LupI-MSSS产量的影响 | 第36-38页 |
| 3.3.1.4 诱导剂浓度对LupI-MSSS产量的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.1.5 诱导温度对LupI-MSSS产量的影响 | 第39页 |
| 3.3.1.6 诱导时间对LupI-MSSS产量的影响 | 第39-41页 |
| 3.3.1.7 摇床转速对LupI-MSSS产量的影响 | 第41-42页 |
| 3.3.2 响应面法优化LupI-MSSS表达条件 | 第42-46页 |
| 3.3.2.1 用Plackett-Burman试验筛选主要影响因素 | 第42-43页 |
| 3.3.2.2 响应面设计法确定最优培养条件及回归方程的建立 | 第43-46页 |
| 3.3.2.3 模型验证试验 | 第46页 |
| 3.4 本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 抑制剂LupI-MSSS的纯化 | 第47-55页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第47-48页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第47-48页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第48页 |
| 4.2 试验方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 粗蛋白溶液的制备 | 第48页 |
| 4.2.2 抑制活性的测定 | 第48页 |
| 4.2.3 蛋白含量测定 | 第48页 |
| 4.2.4 抑制剂LupI-MSSS的纯化 | 第48-49页 |
| 4.2.4.1 超滤 | 第48-49页 |
| 4.2.4.2 Superdex 200 凝胶过滤层析 | 第49页 |
| 4.2.4.3 Q-Sepharose离子交换层析 | 第49页 |
| 4.2.5 SDS-PAGE | 第49页 |
| 4.2.6 抑制剂LupI-MSSS纯度测定 | 第49页 |
| 4.3 试验结果 | 第49-54页 |
| 4.3.1 蛋白标准曲线的绘制 | 第49-50页 |
| 4.3.2 超滤 | 第50页 |
| 4.3.3 Superdex 200 凝胶过滤层析 | 第50-51页 |
| 4.3.4 Q-Sepharose离子交换层析 | 第51-52页 |
| 4.3.5 抑制剂LupI-MSSS纯化结果 | 第52页 |
| 4.3.6 SDS-PAGE电泳 | 第52-53页 |
| 4.3.7 LupI-MSSS纯度鉴定结果 | 第53-54页 |
| 4.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第五章 LupI-MSSS的结晶条件初筛 | 第55-65页 |
| 5.1 材料与仪器 | 第55-56页 |
| 5.2 试验方法 | 第56-57页 |
| 5.2.1 蛋白样品溶液的准备 | 第56页 |
| 5.2.2 悬滴制备与点样 | 第56页 |
| 5.2.3 晶体培养与观察 | 第56页 |
| 5.2.4 晶体挑取验证 | 第56-57页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第57-63页 |
| 5.3.1 晶体观察结果 | 第57-62页 |
| 5.3.2 晶体验证结果 | 第62-63页 |
| 5.4 本章小结 | 第63-65页 |
| 结论与展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
