| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-20页 |
| 1. 粘质沙雷氏菌与灵菌红素 | 第12-17页 |
| ·粘质沙雷氏菌 | 第12页 |
| ·灵菌红素 | 第12-17页 |
| ·灵菌红素的分类及特性 | 第13-14页 |
| ·灵菌红素的研究进展 | 第14-15页 |
| ·灵菌红素的生物合成途径 | 第15-17页 |
| ·灵菌红素的未来展望 | 第17页 |
| 2. 蛋白质的X-射线晶体学 | 第17-20页 |
| ·影响重金属结合的原因 | 第18-20页 |
| ·pH值的影响 | 第18页 |
| ·缓冲液 | 第18-19页 |
| ·沉淀剂 | 第19页 |
| ·重金属浓度、浸泡时间和温度 | 第19-20页 |
| 第一章 灵菌红素MBC合成途径中脯氨酰化-ATP连接酶PigI和黄素蛋白脱氢酶PigA基因的克隆、异源表达、表达产物的纯化 | 第20-34页 |
| ·实验材料 | 第20-21页 |
| ·质粒及宿主菌 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20页 |
| ·沙雷氏菌FS14基因组DNA | 第20页 |
| ·酶和试剂 | 第20-21页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·实验方法 | 第21-25页 |
| ·pigI和pigA基因编码蛋白质的序列分析 | 第21页 |
| ·pigI基因原核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第21-24页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第21-22页 |
| ·沙雷氏菌FS14中pigI基因的PCR扩增 | 第22-23页 |
| ·PCR扩增产物的胶回收纯化 | 第23页 |
| ·质粒pET24b的小量制备 | 第23页 |
| ·PCR扩增产物和载体质粒的酶切、纯化 | 第23页 |
| ·目的基因与载体的连接、转化 | 第23-24页 |
| ·重组质粒DNA序列测定 | 第24页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第24-25页 |
| ·PigI和PigA蛋白的诱导表达 | 第24页 |
| ·PigI和PigA蛋白表达条件优化 | 第24-25页 |
| ·PigI和PigA蛋白的小量纯化 | 第25页 |
| ·结果与分析 | 第25-33页 |
| ·PigI蛋白 | 第25-29页 |
| ·pigI基因所编码蛋白的结构特征分析 | 第25-26页 |
| ·pigI基因的克隆与鉴定 | 第26-27页 |
| ·PigI蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第27页 |
| ·PigI蛋白表达条件的优化 | 第27-28页 |
| ·PigI蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| ·PigA蛋白 | 第29-33页 |
| ·pigA基因所编码蛋白的结构特征分析 | 第29页 |
| ·pigA基因的克隆与鉴定 | 第29-30页 |
| ·PigA蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第30-31页 |
| ·PigA蛋白表达条件的优化 | 第31-32页 |
| ·PigA蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| ·讨论 | 第33页 |
| ·小结 | 第33-34页 |
| 第二章 灵菌红素MBC合成途径中脯氨酰化-ATP连接酶PigI结晶条件的筛选,优化晶体以及蛋白晶体三维结构的解析 | 第34-46页 |
| ·实验材料 | 第34-35页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-38页 |
| ·PigI蛋白甲基化处理 | 第35页 |
| ·PigI蛋白凝胶过滤层析 | 第35页 |
| ·PigI蛋白结晶条件的筛选 | 第35-36页 |
| ·PigI蛋白晶体的优化 | 第36页 |
| ·PigI蛋白与催化底物L-pro,小分子ATP共结晶 | 第36页 |
| ·PigI蛋白与重金属共结晶以及用重金属浸泡 | 第36页 |
| ·PigI蛋白晶体的冻存 | 第36页 |
| ·PigI蛋白晶体的X-射线衍射及衍射数据的处理 | 第36-37页 |
| ·PigI硒代蛋白在M9培养基中优化表达条件 | 第37页 |
| ·PigI硒代蛋白突变体的纯化、结晶、衍射数据的收集及处理 | 第37-38页 |
| ·结果与讨论 | 第38-44页 |
| ·PigI蛋白凝胶过滤层析结果 | 第38-39页 |
| ·PigI蛋白晶体及衍射结果 | 第39页 |
| ·PigI蛋白与催化底物以及小分子共结晶及衍射结果 | 第39-40页 |
| ·PigI硒代蛋白在M9培养基中优化表达条件 | 第40-41页 |
| ·PigI硒代蛋白的大量纯化 | 第41-42页 |
| ·PigI硒代蛋白凝胶过滤层析结果 | 第42-44页 |
| ·讨论 | 第44页 |
| ·小结 | 第44-46页 |
| 第三章 灵菌红素MBC合成途径中黄素蛋白脱氢酶PigA结晶条件的筛选、优化晶体及其三维结构的解析 | 第46-58页 |
| ·实验材料 | 第46-47页 |
| ·主要试剂 | 第46页 |
| ·主要仪器 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-48页 |
| ·PigA蛋白凝胶过滤层析 | 第47页 |
| ·PigA蛋白结晶条件的筛选 | 第47页 |
| ·PigA蛋白晶体的优化 | 第47页 |
| ·PigA蛋白晶体的冻存 | 第47-48页 |
| ·PigA蛋白晶体的X-射线衍射及衍射数据的处理 | 第48页 |
| ·结果 | 第48-56页 |
| ·PigA蛋白凝胶过滤层析结果 | 第48-49页 |
| ·PigA蛋白晶体及衍射结果 | 第49页 |
| ·PigA蛋白晶体优化后衍射结果 | 第49-50页 |
| ·PigA蛋白晶体结构的解析 | 第50-56页 |
| ·讨论 | 第56-57页 |
| ·小结 | 第57-58页 |
| 全文总结 | 第58-60页 |
| 论文的创新点 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 附录 | 第66-74页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第74-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
