| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-16页 |
| 第一章 锌指核酸酶介导的基因打靶 | 第16-40页 |
| ·基因打靶 | 第16-18页 |
| ·基因打靶的含义及起源 | 第17页 |
| ·基因打靶的应用及发展 | 第17-18页 |
| ·细胞DSB修复通路 | 第18-20页 |
| ·同源重组(HR) | 第18-20页 |
| ·单链退火(SSA) | 第20页 |
| ·非同源末端连接(NHEJ) | 第20页 |
| ·嵌合体酶 | 第20-21页 |
| ·Ⅱ型限制性酶 | 第21页 |
| ·用于基因打靶的嵌合酶 | 第21页 |
| ·锌指核酸酶 | 第21-32页 |
| ·锌指结构 | 第22页 |
| ·锌指蛋白分类及其生物学作用 | 第22-24页 |
| ·锌指与DNA相互作用 | 第24-25页 |
| ·人工锌指转录因子及其应用 | 第25-27页 |
| ·锌指核酸酶概述 | 第27-28页 |
| ·ZFN的设计策略 | 第28-30页 |
| ·ZFN在线设计平台 | 第30-32页 |
| ·锌指核酸酶在基因打靶中的应用 | 第32-37页 |
| ·ZFNS应用于模式生物 | 第32-35页 |
| ·ZFNS应用于人类细胞 | 第35-36页 |
| ·ZFNS应用于其他哺乳动物 | 第36-37页 |
| ·ZFN技术存在问题及应对策略 | 第37-40页 |
| ·ZFN引发的细胞毒性 | 第37-38页 |
| ·ZFN中靶细胞的富集 | 第38-40页 |
| 第二章 MSTN研究进展 | 第40-50页 |
| ·MSTN失活及转基因表型 | 第40-43页 |
| ·鼠类中发现的MSTN失活表型 | 第40-41页 |
| ·家养动物中发现的MSTN失活表型 | 第41-42页 |
| ·人类中发现的MSTN失活表型 | 第42页 |
| ·鱼类中MSTN失活表型 | 第42-43页 |
| ·MSTN的调控通路 | 第43-46页 |
| ·蛋白酶加工和生物活性调节 | 第43页 |
| ·成肌细胞增殖、分化和静止的调控 | 第43-45页 |
| ·MSTN作用受体及其信号 | 第45-46页 |
| ·MSTN的功能和比较基因组学 | 第46-48页 |
| ·基因组组成 | 第46页 |
| ·基因的表达差异 | 第46-48页 |
| ·MSTN在生物医学、农业及进化科学中的潜在影响 | 第48-50页 |
| 第三章 靶向绵羊MSTN基因特异性锌指蛋白库的筛选与组装 | 第50-62页 |
| ·材料 | 第50-51页 |
| ·实验所需质粒及菌株 | 第50页 |
| ·实验所需试剂及工具酶 | 第50-51页 |
| ·方法 | 第51-58页 |
| ·MSTN基因靶位点的选择 | 第51页 |
| ·报告载体及报告菌株的构建 | 第51-53页 |
| ·随机锌指蛋白库的构建 | 第53-55页 |
| ·特异性识别绵羊MSTN基因锌指蛋白库的筛选及组装 | 第55-58页 |
| ·结果与分析 | 第58-60页 |
| ·MSTN基因潜在锌指结合靶位点的选择及报告载体构建 | 第58页 |
| ·随机锌指蛋白库的构建 | 第58-59页 |
| ·有效锌指库筛选 | 第59页 |
| ·有效锌指库的连接组装 | 第59页 |
| ·识别绵羊MSTN基因单侧靶序列锌指蛋白的筛选和亲和性分析 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 第四章 锌指核酸酶在酵母系统中的活性验证 | 第62-68页 |
| ·材料 | 第63页 |
| ·实验所需菌种或质粒 | 第63页 |
| ·工具酶及试剂 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-65页 |
| ·酵母报告载体及报告菌株的构建 | 第63-64页 |
| ·ZFN酵母表达载体的构建 | 第64页 |
| ·酵母系统中ZFN活性检测 | 第64-65页 |
| ·结果与分析 | 第65-66页 |
| ·酵母报告载体和表达载体的构建 | 第65页 |
| ·锌指核酸酶活性酵母水平的检测 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-67页 |
| ·小结 | 第67-68页 |
| 第五章 腺病毒介导的ZFN靶向作用于绵羊MSTN基因 | 第68-87页 |
| ·材料与方法 | 第69-77页 |
| ·材料 | 第69-70页 |
| ·方法 | 第70-77页 |
| ·结果及分析 | 第77-84页 |
| ·相关片段的克隆及鉴定 | 第77页 |
| ·穿梭载体的构建及验证 | 第77-78页 |
| ·重组腺病毒载体的构建 | 第78-79页 |
| ·病毒颗粒包装及滴度测定 | 第79-80页 |
| ·重组病毒PCR鉴定及目的蛋白表达检测 | 第80-81页 |
| ·腺病毒感染绵羊胎儿成纤维细胞 | 第81-82页 |
| ·流式细胞仪检测ZFN作用效率 | 第82-83页 |
| ·SURVEYOR法及测序检测突变 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-86页 |
| ·小结 | 第86-87页 |
| 第六章 质粒介导的ZFN靶向作用于绵羊MSTN基因 | 第87-97页 |
| ·材料与方法 | 第87-90页 |
| ·实验材料 | 第87-88页 |
| ·实验方法 | 第88-90页 |
| ·结果与分析 | 第90-93页 |
| ·293T细胞中ZFN活性检测 | 第90-91页 |
| ·绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN活性检测 | 第91-93页 |
| ·讨论 | 第93-96页 |
| ·小结 | 第96-97页 |
| 第七章 哺乳动物细胞中有限表达锌指核酸酶报告系统的建立 | 第97-104页 |
| ·材料与方法 | 第97-98页 |
| ·实验材料 | 第97页 |
| ·有限表达报告载体构建 | 第97-98页 |
| ·细胞培养及转染 | 第98页 |
| ·有限表达锌指核酸酶活性检测 | 第98页 |
| ·锌指核酸酶相关细胞毒性检测 | 第98页 |
| ·结果与分析 | 第98-101页 |
| ·有限表达报告系统的设计和构建 | 第98-99页 |
| ·有限表达ZFN活性的分析 | 第99-100页 |
| ·ZFN过量表达对细胞毒性的检测 | 第100-101页 |
| ·讨论 | 第101-103页 |
| ·小结 | 第103-104页 |
| 结论与创新点 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-118页 |
| 附表 | 第118-120页 |
| 缩略词 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-123页 |
| 作者简介 | 第123-125页 |
