| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-18页 |
| 符号说明 | 第18-19页 |
| 第1章 绪论 | 第19-53页 |
| ·前言 | 第19-20页 |
| ·蜘蛛丝简介 | 第20-23页 |
| ·蛛丝蛋白编码基因克隆、表达及仿生 | 第23-33页 |
| ·蛛丝蛋白编码基因克隆 | 第24-31页 |
| ·蛛丝蛋白的外源制备 | 第31-32页 |
| ·重组蛛丝蛋白纤维的仿生 | 第32-33页 |
| ·蛛丝蛋白结构与功能以及成丝机理研究 | 第33-41页 |
| ·蛛丝蛋白分泌腺结构及内环境 | 第33-34页 |
| ·蛛丝蛋白结构研究 | 第34-40页 |
| ·蛛丝蛋白成丝模型 | 第40-41页 |
| ·本工作的研究背景和意义 | 第41-43页 |
| 参考文献 | 第43-53页 |
| 第2章 A. ventricosus MiSp全长编码基因鉴定与分析 | 第53-81页 |
| 摘要 | 第53-54页 |
| ·前言 | 第54-55页 |
| ·材料与方法 | 第55-59页 |
| ·材料、药品及试剂 | 第55页 |
| ·常用试剂配制及实验方法 | 第55-56页 |
| ·STS/3D-PCR筛选引物设计及优化 | 第56-57页 |
| ·MiSp C端结构域简并引物设计 | 第56页 |
| ·简并PCR扩增及STS的确定 | 第56页 |
| ·PCR筛选特异性引物的鉴定 | 第56-57页 |
| ·-80℃冻存文库的转接培养 | 第57页 |
| ·多级混合池构建、阳性克隆鉴定及全长测序 | 第57-58页 |
| ·基因内含子的鉴定 | 第58-59页 |
| ·序列分析软件及程序 | 第59页 |
| ·结果 | 第59-73页 |
| ·筛选引物鉴定及阳性克隆筛选 | 第59页 |
| ·Shotgun全长测序及序列组成 | 第59-61页 |
| ·MiSp intron的鉴定及验证 | 第61-62页 |
| ·MiSp编码基因上下游UTR分析 | 第62-63页 |
| ·MiSp重复区序列分析 | 第63-65页 |
| ·MiSp spacer结构域 | 第65-68页 |
| ·MiSp非重复N和C端结构域 | 第68-73页 |
| ·讨论 | 第73-78页 |
| ·A.ventricosus MiSp | 第73-75页 |
| ·MiSp蛋白编码基因结构 | 第75-78页 |
| 结语 | 第78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 第3章 A.ventricosus MiSp结构、功能及成丝机理研究 | 第81-129页 |
| 摘要 | 第81-82页 |
| ·前言 | 第82-84页 |
| ·材料与方法 | 第84-91页 |
| ·材料、药品及试剂 | 第84-85页 |
| ·常用试剂配制 | 第85-86页 |
| ·化学转化 | 第86页 |
| ·克隆构建 | 第86-87页 |
| ·诱导表达 | 第87页 |
| ·重组蛋白纯化 | 第87页 |
| ·Tryptophan荧光检测 | 第87-88页 |
| ·ESI-MS和HDX-MS质谱分析 | 第88-89页 |
| ·SEC凝胶过滤层析 | 第89页 |
| ·CD光谱测试 | 第89页 |
| ·尿素变性分析 | 第89-90页 |
| ·NMR结构解析 | 第90-91页 |
| ·β-sheet纳米纤维ThT荧光检测 | 第91页 |
| ·Congo red染色 | 第91页 |
| ·TEM表征 | 第91页 |
| ·结果 | 第91-121页 |
| ·A. ventricosus MiSp NT蛋白研究 | 第91-105页 |
| ·A. ventricosus MiSp N端结构域的表达 | 第91-94页 |
| ·mini-NT和NT相似性比较 | 第94-96页 |
| ·mini-NT单体/二聚体的pH及NaCl敏感性 | 第96-98页 |
| ·mini-NT二级机构及稳定性分析 | 第98-101页 |
| ·mini-NT自组装趋势分析 | 第101-102页 |
| ·mini-NT NMR结构解析 | 第102-105页 |
| ·A. ventricosus MiSp CT蛋白研究 | 第105-117页 |
| ·MiSp CT的外源表达 | 第105-106页 |
| ·MiSp CT二级结构及稳定性 | 第106-108页 |
| ·MiSp CT构象及结构变化 | 第108-111页 |
| ·MiSp CT自组装纤维化 | 第111-114页 |
| ·MiSp CT NMR结构解析以及CO_2作用机制 | 第114-117页 |
| ·A.ventricosus MiSp spacer蛋白研究 | 第117-121页 |
| ·MiSp spacer的重组表达 | 第117-118页 |
| ·MiSp spacer二级结构及稳定性 | 第118-119页 |
| ·MiSp spacer构象分析及NMR结构解析 | 第119-121页 |
| ·讨论 | 第121-126页 |
| ·MiSp非重复模块的外源表达 | 第121-122页 |
| ·MiSp非重复模块结构及多聚化 | 第122-125页 |
| ·MiSp非重复模块自组装及纤维化 | 第125-126页 |
| 结语 | 第126页 |
| 参考文献 | 第126-129页 |
| 第4章 Intein介导全长Misp蛋白的定向拼接 | 第129-145页 |
| 摘要 | 第129-130页 |
| ·前言 | 第130-131页 |
| ·材料与方法 | 第131-135页 |
| ·材料、药品及试剂 | 第131页 |
| ·常用试剂配制 | 第131-132页 |
| ·Rosetta 2(DE3)或者BL21(DE3)的化学转化 | 第132-133页 |
| ·克隆构建 | 第133-134页 |
| ·目的蛋白诱导表达 | 第134页 |
| ·表达菌体裂解及重组蛋白纯化 | 第134-135页 |
| ·融合蛋白的体外反式剪接 | 第135页 |
| ·Western blotting | 第135页 |
| ·结果 | 第135-139页 |
| ·A. ventricosus MiSp全长编码基因的表达 | 第135-136页 |
| ·Rb intein介导 A. ventricosus MiSp的定向拼接 | 第136-137页 |
| ·Rb intein trans-splicing介导的融合蛋白全长拼接 | 第137-139页 |
| ·讨论 | 第139-140页 |
| 结语 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-145页 |
| 第5章 结论及展望 | 第145-149页 |
| ·结论 | 第145-147页 |
| ·蛛丝蛋白全长编码基因克隆鉴定：世界上首条MiSp全长编码基因 | 第145页 |
| ·蛛丝蛋白结构、功能和成丝机理研究：全新的成丝机理模型 | 第145-147页 |
| ·全长蛛丝蛋白的体外定向拼接：首次实现全长蛛丝蛋白的外源制备 | 第147页 |
| ·展望 | 第147-149页 |
| 博士期间发表论文、奖励和参加科研情况 | 第149-151页 |
| 致谢 | 第151页 |
