| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-11页 |
| 插图和附表清单 | 第11-14页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 1 引言 | 第15-32页 |
| ·布鲁氏菌病概述 | 第15页 |
| ·布鲁氏菌病病原学 | 第15-21页 |
| ·分类学地位 | 第15-16页 |
| ·形态学特征 | 第16页 |
| ·培养特性 | 第16-17页 |
| ·抵抗力 | 第17页 |
| ·细菌结构 | 第17-20页 |
| ·基因组结构 | 第20-21页 |
| ·布鲁氏菌的致病机理 | 第21页 |
| ·布鲁氏菌病的临床症状 | 第21页 |
| ·布鲁氏菌病的流行病学 | 第21页 |
| ·布鲁氏菌病的防治 | 第21-22页 |
| ·布鲁氏菌检测方法的研究进展 | 第22-25页 |
| ·布鲁氏菌的分离鉴定 | 第22页 |
| ·布鲁氏菌分子生物学检测 | 第22-24页 |
| ·布鲁氏菌的免疫学检测 | 第24-25页 |
| ·新型检测技术的原理及应用 | 第25-30页 |
| ·多重PCR技术 | 第25页 |
| ·荧光定量PCR技术 | 第25-29页 |
| ·胶体金免疫层析技术 | 第29-30页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第30-32页 |
| 2 试验一 布鲁氏菌胶体金试纸检测方法的建立 | 第32-66页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·菌株及血清 | 第33页 |
| ·主要试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33-34页 |
| ·方法 | 第34-48页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·细菌基于组DNA的提取 | 第34页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因的纯化回收 | 第35页 |
| ·表达感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因的克隆 | 第36页 |
| ·目的基因与表达载体连接 | 第36页 |
| ·连接产物的转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆菌的筛选 | 第36页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因的序列分析 | 第36页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因重组质粒的提取 | 第36-37页 |
| ·bp26重组蛋白的表达 | 第37-38页 |
| ·bp26重组蛋白Wes tern blot鉴定 | 第38-39页 |
| ·bp26重组蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| ·bp26重组蛋白的复性 | 第40页 |
| ·测定的bp26重组蛋白的浓度 | 第40页 |
| ·胶体金的制备 | 第40-41页 |
| ·SPA与胶体金颗粒结合的pH值优化 | 第41-42页 |
| ·SPA与胶体金颗粒结合的浓度优化 | 第42页 |
| ·胶体金SPA探针的制备与纯化 | 第42-43页 |
| ·胶体金SPA探针包被玻璃纤维 | 第43页 |
| ·包被硝酸纤维素膜(NC膜) | 第43页 |
| ·试纸条的组装 | 第43-44页 |
| ·试纸条的使用 | 第44页 |
| ·重组bp26蛋白与金标-SPA组合浓度选择 | 第44页 |
| ·重组bp26蛋白和羊血清lgG合浓度选择 | 第44-45页 |
| ·试纸条的敏感性试验 | 第45页 |
| ·试纸条的特异性试验 | 第45页 |
| ·试纸条的稳定性试验 | 第45页 |
| ·布鲁氏菌胶体金检测方法与其它血清学检测方法的比较 | 第45-48页 |
| ·虎红平板凝集试验(RBT) | 第45页 |
| ·试管凝集试验(SAT) | 第45-47页 |
| ·酶联免疫吸附试验(I-ELISA) | 第47-48页 |
| ·胶体金免疫层析(GICA) | 第48页 |
| ·结果 | 第48-63页 |
| ·布鲁氏菌bp26基于的PCR的扩增 | 第48页 |
| ·重组bp26基于克隆菌的筛选 | 第48-49页 |
| ·布鲁氏菌bp26基因序列分析 | 第49-50页 |
| ·布鲁氏菌bp26基于的原核表达 | 第50-51页 |
| ·重组bp26蛋白的Westen blot鉴定 | 第51页 |
| ·bp26重组蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| ·纯化重组蛋白bp26的浓度测定 | 第52页 |
| ·胶体金的制备 | 第52页 |
| ·SPA与胶体金结合的最佳pH确定 | 第52页 |
| ·SPA与胶体金结合的最佳浓度的确定 | 第52-53页 |
| ·重组bp26蛋白和金标SPA组合浓度选择 | 第53页 |
| ·重组bp26蛋白抗原和羊血清IgG最适浓度组合 | 第53-54页 |
| ·试纸条的特异性分析 | 第54页 |
| ·试纸条的灵敏性分析 | 第54-55页 |
| ·试纸条的稳定性试验 | 第55页 |
| ·布鲁氏菌胶体金检测方法与其它血清学检测方法的比较 | 第55-63页 |
| ·讨论 | 第63-65页 |
| ·小结 | 第65-66页 |
| 3 试验二 布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立 | 第66-82页 |
| ·材料 | 第67页 |
| ·菌株 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·主要仪器 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-72页 |
| ·引物和探针设计 | 第67-68页 |
| ·常用试剂配制 | 第68页 |
| ·细菌基因组的提取 | 第68页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因的PCR扩增 | 第68页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因的纯化回收 | 第68页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第68页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因的克隆 | 第68-69页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因重组质粒的提取 | 第69页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因重组质粒的序列分析 | 第69页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因重组质粒浓度的测定 | 第69-70页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR检测的反应体系 | 第70页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR检测反应条件优化 | 第70页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR引物与探针浓度优化 | 第70-71页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR的特异性分析 | 第71页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR标准曲线的构建 | 第71页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR的灵敏性分析 | 第71页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR的标准品的稳定性分析 | 第71页 |
| ·血清中布鲁氏菌的荧光定量PCR检测 | 第71-72页 |
| ·结果 | 第72-79页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因的PCR扩增 | 第72页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因阳性克隆菌的筛选 | 第72-73页 |
| ·布鲁氏菌OMP10基因序列分析 | 第73-74页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR反应条件的优化 | 第74页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR反应引物和探针浓度优化 | 第74页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR检测的特异性分析 | 第74-75页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR标准曲线构建 | 第75-76页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR灵敏性分析 | 第76-77页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR检测标准品稳定性分析 | 第77-78页 |
| ·血清中布鲁氏菌的荧光定量PCR检测 | 第78-79页 |
| ·讨论 | 第79-80页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR引物和探针设计 | 第79页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR标准品的构建 | 第79页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第79-80页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR的荧光域值设定 | 第80页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR假阳性和假阴性 | 第80页 |
| ·布鲁氏菌荧光定量PCR技术存在的问题 | 第80页 |
| ·小结 | 第80-82页 |
| 4 试验三 布鲁氏菌分型多重PCR检测方法的建立 | 第82-95页 |
| ·材料 | 第82-83页 |
| ·菌株 | 第82-83页 |
| ·主要试剂 | 第83页 |
| ·主要仪器 | 第83页 |
| ·方法 | 第83-86页 |
| ·引物设计 | 第83页 |
| ·细菌基因组的提取 | 第83-84页 |
| ·牛种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第84页 |
| ·羊种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第84页 |
| ·猪种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第84-85页 |
| ·布鲁氏菌分型引物的特异性分析 | 第85页 |
| ·布鲁氏菌多重PCR检测方法的建立 | 第85页 |
| ·布鲁氏菌多重PCR检测方法的特异性分析 | 第85页 |
| ·布鲁氏菌多重PCR检测方法的灵敏性分析 | 第85页 |
| ·布鲁氏菌多重PCR检测方法的稳定性分析 | 第85页 |
| ·样本的布鲁氏菌多重PCR检测 | 第85-86页 |
| ·结果 | 第86-93页 |
| ·牛种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第86-87页 |
| ·羊种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第87-88页 |
| ·猪种布鲁氏菌单重PCR检测方法的建立 | 第88-89页 |
| ·布鲁氏菌分型引物的特异性分析 | 第89-90页 |
| ·布鲁氏菌分型多重PCR检测方法的建立 | 第90-91页 |
| ·布鲁氏菌分型多重PCR检测方法的特异性分析 | 第91-92页 |
| ·布鲁氏菌分型多重PCR检测方法的灵敏性分析 | 第92-93页 |
| ·布鲁氏菌分型多重PCR检测方法的稳定性分析 | 第93页 |
| ·样本的布鲁氏菌多重PCR检测 | 第93页 |
| ·讨论 | 第93-94页 |
| ·小结 | 第94-95页 |
| 5 结论 | 第95页 |
| 6 展望 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-103页 |
| 附录 | 第103-104页 |
| 作者简介 | 第104页 |