| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-17页 |
| 第1章 引言 | 第17-30页 |
| ·本论文的研究背景 | 第17-19页 |
| ·高危型HPV16 与宫颈癌 | 第17页 |
| ·HPV16 的分子生物学特征 | 第17页 |
| ·HPV16 的基因序列结构 | 第17-18页 |
| ·HPV16 的复制 | 第18页 |
| ·HPV16 的致病机制 | 第18-19页 |
| ·研究目的及意义 | 第19-20页 |
| ·国内外HPV 检测方法研究现状 | 第20-23页 |
| ·传统的细胞学检测方法及其进展 | 第20-21页 |
| ·HPVDNA 检测方法 | 第21-23页 |
| ·建立高危型人乳头瘤病毒快速检测方法的迫切需要 | 第23-25页 |
| ·研究目标、内容、拟解决的关键问题、实验方法、技术路线和实验方案 | 第25-30页 |
| ·研究目标 | 第25页 |
| ·研究内容 | 第25-26页 |
| ·用基因工程技术制备HPV16E6 蛋白 | 第25页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白多克隆抗体的制备 | 第25页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单克隆抗体的制备、筛选、鉴定 | 第25-26页 |
| ·建立免疫组织化学法检测HPV16E6 蛋白 | 第26页 |
| ·建立检测HPV16E6 蛋白的ELISA 方法 | 第26页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单克隆抗体在免疫胶体金试剂条中的应用 | 第26页 |
| ·拟解决的关键问题 | 第26-27页 |
| ·HPV16E6 蛋白的制备 | 第26页 |
| ·细胞融合 | 第26页 |
| ·胶体金对抗体的标记 | 第26-27页 |
| ·免疫胶体金试剂条中纤维膜的处理 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27页 |
| ·用基因工程技术获得 HPV16 基因的致癌蛋白HPV16E6 蛋白 | 第27页 |
| ·单克隆抗体和多克隆抗体的制备方法，标记抗体和诊断抗体用 | 第27页 |
| ·间接ELISA 筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株； | 第27页 |
| ·抗体纯化方法：盐析、透析、柱层析、亲和层析等； | 第27页 |
| ·建立双抗夹心ELISA 法检测HPV16E6 蛋白； | 第27页 |
| ·胶体金标记方法和标记抗体纯化方法：离心浓缩纯化 | 第27页 |
| ·技术路线和实验方案 | 第27-30页 |
| ·技术路线 | 第27-28页 |
| ·实验方案 | 第28-30页 |
| 第2章 HPV16E6 基因的构建与表达，HPV16E6 蛋白的纯化 | 第30-53页 |
| ·HPV16 E6 基因原核表达质粒的构建 | 第30-39页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·实验材料 | 第30页 |
| ·仪器设备 | 第30页 |
| ·实验试剂 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-33页 |
| ·引物的设计 | 第31页 |
| ·CaSki 细胞基因组总DNA 的提取 | 第31页 |
| ·PCR 扩增和胶回收HPV16E6 基因 | 第31-32页 |
| ·质粒载体的提取 | 第32页 |
| ·质粒载体的酶切 | 第32页 |
| ·HPV16E6 基因的酶切 | 第32页 |
| ·质粒与目的基因的连接 | 第32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| ·重组质粒阳性克隆子的筛选 | 第33页 |
| ·HPV16 E6 基因原核表达质粒的构建 | 第33页 |
| ·结果 | 第33-39页 |
| ·HPV16E6 的PCR 产物结果 | 第33-34页 |
| ·pET-28a(+)-HPV16 E6 重组质粒的菌落PCR 鉴定结果 | 第34-35页 |
| ·pET28a(+)-HPV16 E6 重组质粒酶切鉴定结果 | 第35页 |
| ·DNA 测序结果 | 第35-39页 |
| ·讨论 | 第39页 |
| ·HPV16E6 基因在大肠杆菌中的表达 | 第39-42页 |
| ·材料 | 第39-40页 |
| ·实验材料 | 第39-40页 |
| ·试剂配方 | 第40页 |
| ·方法 | 第40-41页 |
| ·pET-28a(+)-HPV16 E6 重组质粒的构建 | 第40页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-HPV16E6 在大肠杆菌中的诱导表达 | 第40-41页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测菌液中的HPV16E6 蛋白 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-42页 |
| ·讨论 | 第42页 |
| ·Western blotting 鉴定HPV16E6 蛋白 | 第42-46页 |
| ·材料与试剂 | 第42-43页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-44页 |
| ·转膜 | 第44页 |
| ·封闭 | 第44页 |
| ·加一抗 | 第44页 |
| ·加二抗 | 第44页 |
| ·显色 | 第44页 |
| ·结果 | 第44-45页 |
| ·讨论 | 第45-46页 |
| ·HPV16E6 蛋白的纯化 | 第46-49页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·材料与试剂 | 第46页 |
| ·试剂配方 | 第46-47页 |
| ·方法 | 第47-48页 |
| ·IPTG 诱导表达HPV16E6 蛋白 | 第47页 |
| ·破菌处理 | 第47页 |
| ·HPV16E6 蛋白包涵体的洗涤 | 第47页 |
| ·镍柱亲和层析纯化HPV16E6 蛋白 | 第47-48页 |
| ·结果 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49页 |
| ·Lowry 法测定HPV16E6 蛋白的浓度 | 第49-53页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·试剂甲 | 第49页 |
| ·试剂乙 | 第49页 |
| ·标准蛋白质溶液 | 第49-50页 |
| ·待测样品 | 第50页 |
| ·Lowry 法的原理 | 第50页 |
| ·方法 | 第50页 |
| ·结果 | 第50-52页 |
| ·Lowry 法测定HPV16E6 蛋白的A570 值 | 第50-51页 |
| ·Lowry 法测定HPV16E6 蛋白浓度的标准曲线 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-53页 |
| 第3章 抗 HPV16E6 蛋白多克隆抗体的制备 | 第53-58页 |
| ·材料 | 第53页 |
| ·实验材料 | 第53页 |
| ·试剂 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-55页 |
| ·免疫方案 | 第53-54页 |
| ·间接ELISA 法测定兔抗HPV16E6 蛋白多抗的效价 | 第54页 |
| ·兔抗HPV16E6 蛋白多抗的纯化 | 第54-55页 |
| ·Lowry 法测粗提兔抗HPV16E6 多抗IgG 的浓度 | 第55页 |
| ·结果 | 第55-57页 |
| ·间接ELISA 法第一次测定兔抗HPV16E6 蛋白多抗的效价结果 | 第55-56页 |
| ·12% SDS-PAGE 变性还原电泳鉴定粗提兔抗HPV16E6 多抗IgG 的纯度 | 第56-57页 |
| ·Lowry 法测粗提兔抗HPV16E6 多抗IgG 的浓度 | 第57页 |
| ·讨论 | 第57-58页 |
| 第4章 鼠抗 HPV16E6 蛋白单克隆抗体的制备 | 第58-78页 |
| ·材料 | 第58-59页 |
| ·动物和细胞 | 第58页 |
| ·主要材料 | 第58页 |
| ·主要仪器 | 第58页 |
| ·试剂配方 | 第58-59页 |
| ·方法 | 第59-65页 |
| ·细胞融合前准备 | 第59-60页 |
| ·免疫方案 | 第59页 |
| ·筛选抗HPV16E6 蛋白阳性克隆方法的建立 | 第59页 |
| ·小鼠腹腔巨噬细胞的制备 | 第59-60页 |
| ·骨髓瘤细胞的培养 | 第60页 |
| ·免疫脾细胞的制备 | 第60页 |
| ·细胞融合 | 第60-61页 |
| ·细胞融合流程 | 第60-61页 |
| ·HAT 选择培养杂交瘤细胞 | 第61页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第61-62页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆化培养和冻存 | 第62-63页 |
| ·第一次有限稀释法克隆化培养 | 第62页 |
| ·第二次有限稀释法克隆化培养 | 第62-63页 |
| ·体内诱生法生产大量的单克隆抗体 | 第63页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白的单抗腹水的制备 | 第63页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单克隆抗体的纯化 | 第63页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定 | 第63-65页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗类型的测定 | 第63页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗特异性的鉴定 | 第63-64页 |
| ·间接ELISA 法检测纯化后的腹水单抗效价 | 第64-65页 |
| ·结果 | 第65-74页 |
| ·建立筛选抗HPV16E6 蛋白阳性克隆的方法结果 | 第65-66页 |
| ·细胞融合的结果 | 第66页 |
| ·阳性克隆的筛选结果 | 第66-67页 |
| ·杂交瘤细胞的克隆化培养结果 | 第67-70页 |
| ·第一次有限稀释法克隆化培养的结果 | 第67-69页 |
| ·第二次有限稀释法克隆化培养的结果 | 第69-70页 |
| ·单抗腹水的纯度鉴定 | 第70-71页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定结果 | 第71-74页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗类型的测定 | 第71页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗特异性的鉴定 | 第71-73页 |
| ·间接ELISA 法检测纯化后的腹水单抗效价 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-78页 |
| ·免疫方案 | 第74页 |
| ·筛选抗HPV16E6 蛋白阳性克隆方法的建立 | 第74页 |
| ·细胞融合前的准备 | 第74-75页 |
| ·小鼠腹腔巨噬细胞的制备 | 第74-75页 |
| ·骨髓瘤细胞SP2/0 的准备 | 第75页 |
| ·小鼠脾脏细胞悬液的制备 | 第75页 |
| ·细胞融合 | 第75-76页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第76页 |
| ·克隆化培养 | 第76页 |
| ·单抗腹水的制备 | 第76页 |
| ·单克隆杂交瘤细胞株的鉴定 | 第76-78页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗类型的测定 | 第76页 |
| ·抗HPV16E6 蛋白单抗的特异性鉴定 | 第76-77页 |
| ·单抗的效价检测 | 第77-78页 |
| 第5章 兔抗鼠 IGG 抗抗体即二抗的制备和纯化 | 第78-81页 |
| ·材料 | 第78页 |
| ·方法 | 第78-79页 |
| ·抗原鼠IgG 制备和纯化 | 第78页 |
| ·免疫方案 | 第78页 |
| ·间接ELISA 检测兔抗鼠IgG 血清抗体效价 | 第78页 |
| ·兔抗鼠IgG 抗体的纯化 | 第78页 |
| ·12% SDS-PAGE 鉴定兔抗鼠IgG 抗抗体纯度 | 第78-79页 |
| ·结果 | 第79-80页 |
| ·间接ELISA 检测兔抗鼠IgG 血清抗体效价结果 | 第79页 |
| ·兔抗鼠IgG 的纯度检测 | 第79-80页 |
| ·讨论 | 第80-81页 |
| 第6章 双抗夹心 ELISA 法检测 HPV16E6 蛋白 | 第81-84页 |
| ·材料 | 第81页 |
| ·方法 | 第81-82页 |
| ·结果 | 第82页 |
| ·讨论 | 第82-84页 |
| 第7章 抗 HPV16E6 蛋白单克隆抗体在免疫胶体金试纸条的应用 | 第84-97页 |
| ·材料 | 第84-85页 |
| ·主要仪器设备 | 第84页 |
| ·主要试剂 | 第84页 |
| ·主要试剂配方 | 第84-85页 |
| ·方法 | 第85-92页 |
| ·胶体金标记技术 | 第85-88页 |
| ·基本原理 | 第85页 |
| ·制备高质量胶体金的注意事项 | 第85-86页 |
| ·胶体金颗粒大小的选择 | 第86页 |
| ·30nm 胶体金颗粒的制备 | 第86页 |
| ·胶体金质量鉴定 | 第86页 |
| ·抗体标记过程中缓冲液的选择 | 第86-87页 |
| ·待标记单抗蛋白溶液的制备 | 第87页 |
| ·待标胶体金溶液的准备 | 第87页 |
| ·待标记抗体最适稳定量的测定 | 第87-88页 |
| ·金标抗体的制备与纯化 | 第88页 |
| ·金标抗体的质量鉴定 | 第88页 |
| ·HPV16 型免疫胶体金诊断试纸条的制备 | 第88-90页 |
| ·结合垫处理液的选择 | 第88-89页 |
| ·样品垫处理液的选择 | 第89页 |
| ·金标抗体（单抗）、兔抗HPV16E6 蛋白多抗、兔抗鼠IgG 喷涂量的确定 | 第89-90页 |
| ·HPV16 型免疫胶体金诊断试纸条的组装 | 第90页 |
| ·HPV16 型免疫胶体金诊断试纸条的测试方法与评判标准 | 第90-91页 |
| ·测试方法 | 第90页 |
| ·HPV16 检测的评判标准 | 第90-91页 |
| ·免疫测试条的稳定性试验 | 第91-92页 |
| ·灵敏度比较 | 第92页 |
| ·特异性比较 | 第92页 |
| ·结果 | 第92-95页 |
| ·待标记单抗最适稳定量的确定 | 第92-93页 |
| ·胶体金溶液的A_(520)值测定结果 | 第93页 |
| ·结合垫和结合垫处理液的选择 | 第93-94页 |
| ·金标抗体、抗HPV16E6 蛋白多抗、兔抗鼠IgG 抗体喷涂量的确定结果 | 第94页 |
| ·灵敏度比较结果 | 第94-95页 |
| ·特异性比较结果 | 第95页 |
| ·讨论 | 第95-97页 |
| ·胶体金颗粒的制备 | 第95-96页 |
| ·金标抗体的制备和纯化 | 第96页 |
| ·样品垫和结合垫处理液的选择 | 第96页 |
| ·金标抗体、多抗、兔抗鼠IgG 抗体的最佳喷涂量的确定 | 第96页 |
| ·HPV16 型免疫胶体金诊断试纸条的组装 | 第96页 |
| ·HPV16 型免疫胶体金诊断试纸条的特异性 | 第96页 |
| ·试纸条的灵敏度比较 | 第96-97页 |
| 第8章 结论与展望 | 第97-100页 |
| ·本研究的技术总结 | 第98页 |
| ·本研究的技术创新点 | 第98-99页 |
| ·本研究的问题与展望 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 | 第103-104页 |
