| 中文摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1.前言 | 第13-25页 |
| ·干扰素的分类 | 第14-16页 |
| ·Ⅰ型干扰素 | 第14-15页 |
| ·Ⅱ型干扰素 | 第15页 |
| ·新型干扰素 | 第15-16页 |
| ·干扰素诱生剂 | 第16页 |
| ·干扰素生成机理 | 第16-17页 |
| ·受体介导方式-Toll 样受体途径的信号转导 | 第16页 |
| ·核酸结合蛋白途径的信号转导 | 第16-17页 |
| ·RIG-Ⅰ/Mda-5 途径 | 第17页 |
| ·PKR 途径 | 第17页 |
| ·干扰素生物学功能 | 第17-19页 |
| ·抗病毒作用 | 第17-18页 |
| ·抗肿瘤作用 | 第18页 |
| ·免疫调节作用 | 第18-19页 |
| ·抗细胞分裂作用 | 第19页 |
| ·其它活性 | 第19页 |
| ·干扰素信号传导途径及诱导基因的激活 | 第19-22页 |
| ·干扰素受体 | 第19-20页 |
| ·信号传导途径 | 第20-21页 |
| ·经典途径 JAK-STAT 通路 | 第20页 |
| ·CRK 介导的信号转导 | 第20-21页 |
| ·干扰素诱导的重要蛋白质及功能 | 第21-22页 |
| ·双链 RNA 依赖性蛋白激酶（PKR） | 第21页 |
| ·寡腺苷酸合成酶和 RNase L 酶 | 第21页 |
| ·Mx 蛋白 | 第21-22页 |
| ·主要组织相容性复合物 | 第22页 |
| ·一氧化氮合成酶 | 第22页 |
| ·基因工程干扰素的临床应用 | 第22-23页 |
| ·研究目的及意义 | 第23-25页 |
| 2.试验材料和方法 | 第25-55页 |
| ·试验材料 | 第25-32页 |
| ·菌种 | 第25页 |
| ·载体 | 第25-26页 |
| ·病毒 | 第26页 |
| ·细胞及培养基 | 第26-27页 |
| ·酶、主要试剂及试剂盒 | 第27页 |
| ·抗体与试剂 | 第27页 |
| ·细胞板和 ELISA 板 | 第27页 |
| ·耗材 | 第27页 |
| ·试验所用试剂及配制 | 第27-32页 |
| ·猪外周血淋巴细胞分离及培养用溶液及配制 | 第27-28页 |
| ·基因克隆及原核表达用溶液及培养基配制 | 第28页 |
| ·蛋白纯化用溶液及配制 | 第28-29页 |
| ·细胞培养及转染用溶液及配制 | 第29页 |
| ·蛋白电泳溶液及配制 | 第29-30页 |
| ·Western-blot 溶液及配制 | 第30页 |
| ·I-ELISA 溶液及配制 | 第30页 |
| ·sf9 昆虫细胞真核表达蛋白用溶液及配制 | 第30-31页 |
| ·提取 Bacmid DNA 的溶液 | 第31页 |
| ·IFA 用溶液及配制 | 第31-32页 |
| ·主要仪器 | 第32页 |
| ·实验动物 | 第32页 |
| ·试验方法 | 第32-55页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因的克隆及序列分析 | 第32-38页 |
| ·猪外周血淋巴细胞的分离及诱导培养 | 第32-33页 |
| ·猪外周血淋巴细胞总 RNA 的提取 | 第33页 |
| ·引物的设计与合成 | 第33-34页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因的扩增 | 第34-35页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因的 PCR 产物胶回收与纯化 | 第35-36页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因 PCR 产物与克隆载体的连接 | 第36页 |
| ·DH5α/ Rosetta 感受态的制备 | 第36页 |
| ·pMD-IFN-α、β、γ转化 DH5α感受态细胞 | 第36页 |
| ·菌落的培养及筛选 | 第36-37页 |
| ·pMD-IFN-α、β、γ质粒的提取 | 第37页 |
| ·pMD-IFN-α、β、γ质粒的 PCR、双酶切鉴定及测序分析 | 第37-38页 |
| ·猪α、β、γ干扰素原核表达载体的构建、表达、纯化 | 第38-43页 |
| ·引物的设计与合成 | 第38-39页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因片段的扩增 | 第39页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因 PCR 产物连接转化 | 第39-40页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因原核表达重组质粒的提取 | 第40页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因原核表达重组质粒的鉴定及测序 | 第40页 |
| ·猪α、β、γ干扰素原核重组蛋白的诱导表达 | 第40页 |
| ·原核表达重组猪α、β、γ干扰素蛋白的 SDS-PAGE 分析 | 第40-41页 |
| ·原核表达重组猪α、β、γ干扰素蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE 分析蛋白纯化效果 | 第42页 |
| ·原核表达重组蛋白的 Western-blot 鉴定 | 第42-43页 |
| ·考马斯亮蓝法测定纯化后蛋白的浓度 | 第43页 |
| ·原核表达重组猪α、β、γ干扰素蛋白鼠源多抗的制备及效价测定 | 第43-44页 |
| ·BALB/c 小鼠的免疫 | 第44页 |
| ·I-ELISA 测定多抗血清效价 | 第44页 |
| ·猪α、β、γ干扰素蛋白在昆虫细胞中的表达 | 第44-52页 |
| ·引物的设计与合成 | 第45页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因片段的扩增 | 第45页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因重组转移载体的构建 | 第45-46页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因重组转移载体的转座 | 第46-47页 |
| ·重组 Bacmid 的提取及鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组 Bacmid 的大量提取 | 第48-49页 |
| ·重组 Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞 | 第49-50页 |
| ·P1 代病毒的扩增 | 第50-51页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第51页 |
| ·猪α、β、γ干扰素蛋白在昆虫细胞中的表达 | 第51-52页 |
| ·表达蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 鉴定 | 第52页 |
| ·表达蛋白的 IFA 鉴定 | 第52页 |
| ·猪α、β、γ干扰素蛋白体外抗病毒活性的测定 | 第52-55页 |
| ·Marc-145 和 MDBK 细胞的培养和鸡胚的孵育 | 第52页 |
| ·PRRSV 和 VSV 扩增 | 第52-53页 |
| ·PRRSV 和 VSV 的 TCID50测定 | 第53页 |
| ·PRRSV/Marc-145 和 VSV/MDBK 系统测定表达蛋白的抗病毒活性 | 第53-55页 |
| 3.结果与分析 | 第55-74页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因克隆及序列分析 | 第55-56页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因克隆及重组克隆载体构建 | 第55-56页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因克隆载体测序及序列分析 | 第56页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因原核表达载体构建及鉴定 | 第56页 |
| ·猪α、β、γ干扰素原核诱导表达 | 第56-57页 |
| ·原核表达重组猪α、β、γ干扰素蛋白的纯化、鉴定 | 第57-58页 |
| ·原核表达蛋白包涵体的纯化 | 第57-58页 |
| ·原核表达蛋白的 Western-blot 鉴定 | 第58页 |
| ·原核表达蛋白的浓度测定 | 第58页 |
| ·原核表达重组猪α、β、γ干扰素蛋白鼠多抗血清效价的检测 | 第58-60页 |
| ·猪α、β、γ干扰素蛋白在昆虫细胞中的表达 | 第60-64页 |
| ·重组转移载体的构建及鉴定 | 第60页 |
| ·重组杆粒的鉴定 | 第60-61页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因重组杆状病毒感染 sf9 细胞后的细胞病变 | 第61页 |
| ·猪α、β、γ干扰素蛋白在 sf9 细胞中表达的 IFA 检测 | 第61-62页 |
| ·sf9 细胞表达蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 鉴定 | 第62-64页 |
| ·PRRSV 和 VSV 病毒 TCID50的测定 | 第64页 |
| ·PRRSV 的 TCID50的测定 | 第64页 |
| ·VSV 的 TCID50的测定 | 第64页 |
| ·PRRSV/Marc-145 和 VSV/MDBK 系统测定表达蛋白的抗病毒活性 | 第64-74页 |
| ·原核、真核表达猪干扰素蛋白作用接毒细胞 Marc-145 的形态学观察 | 第64-66页 |
| ·微量细胞病变抑制法测定原核表达猪干扰素蛋白的抗病毒活性 | 第66-69页 |
| ·原核表达猪 IFN-α抗病毒活性测定 | 第66-67页 |
| ·原核表达猪 IFN-β抗病毒活性测定 | 第67-68页 |
| ·原核表达猪 IFN-γ抗病毒活性测定 | 第68-69页 |
| ·微量细胞病变抑制法测定 sf9 真核表达猪干扰素蛋白的抗病毒活性 | 第69-72页 |
| ·真核表达猪 IFN-α抗病毒活性测定 | 第69-70页 |
| ·真核表达猪 IFN-β抗病毒活性测定 | 第70-71页 |
| ·真核表达猪 IFN-γ抗病毒活性测定 | 第71-72页 |
| ·原核、真核表达猪干扰素蛋白在不同系统上抗病毒活性的比较 | 第72-74页 |
| 4.讨论 | 第74-77页 |
| ·猪α、β、γ干扰素基因的克隆 | 第74页 |
| ·原核表达载体的选择与原核猪α、β、γ干扰素的表达、纯化 | 第74-75页 |
| ·昆虫细胞真核表达猪α、β、γ干扰素 | 第75页 |
| ·重组猪α、β、γ干扰素抗病毒活性的测定 | 第75-77页 |
| 5. 结论 | 第77-78页 |
| 6. 参考文献 | 第78-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第84页 |
