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吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的基因克隆与表达的研究

目录第1-6页
缩写第6-7页
中文摘要第7-10页
Abstract第10-14页
第一章 前言第14-30页
 一、烟碱类农药的发展第14-16页
 二、烟碱类农药合成中间体吡啶衍生物的研究第16-17页
 三、微生物转化烟酸合成吡啶衍生物的研究进展第17-21页
 四、微生物转化烟酸酶的研究进展第21-25页
 五.本课题的研究内容、思路及方法第25-30页
  1.研究内容第25页
  2.研究思路第25页
  3.研究中所涉及的主要研究方法概述第25-30页
第二章 吡啶衍生物的微生物转化及偶联生产工艺的研究第30-51页
 第一节 C.testosteroni JA1菌株培养条件的优化研究第30-37页
  1.材料和方法第30-31页
   ·材料第30页
   ·菌体培养方法第30页
   ·转化方法第30-31页
   ·产物检测方法第31页
  2.结果第31-36页
   ·JA1菌株的生长与产酶曲线第31-32页
   ·碳源对菌体生长和产酶的影响第32页
   ·氮源对菌体生长和产酶的影响第32-33页
   ·诱导物对菌体生长和产酶的影响第33页
   ·金属离子对菌体生长和产酶的影响第33-35页
   ·温度对菌体生长和产酶的影响第35页
   ·初始pH值对菌体生长和产酶的影响第35页
   ·溶解氧量对菌体生长和产酶的影响第35-36页
  3.讨论第36-37页
 第二节 C.testosteroni JA1菌株静息细胞羟基化烟酸的条件优化研究第37-43页
  1.材料和方法第37-38页
   ·材料第37页
   ·菌体培养方法第37页
   ·转化方法第37页
   ·转化产物检测方法第37-38页
  2.结果第38-41页
   ·pH值对转化效率的影响第38页
   ·缓冲介质对转化效率的影响第38-39页
   ·度对转化效率的影响第39页
   ·底物浓度对转化效率的影响第39-40页
   ·菌量对转化效率的影响第40页
   ·转化底物特异性第40-41页
   ·6-羟基烟酸的生产性能评价第41页
  3.讨论第41-43页
 第三节 烟酸和3-氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺的研究第43-51页
  1.材料和方法第43-45页
   ·材料第43页
   ·菌体发酵培养方法第43页
   ·菌体生长细胞的转化方法第43-44页
   ·菌体静息细胞转化方法第44页
   ·转化产物的测定第44页
   ·产物的分离与提纯第44-45页
  2.结果第45-49页
   ·发酵液转化的时间进程第45页
   ·起始烟酸浓度对发酵液中6-羟基烟酸积累的影响第45-46页
   ·回补烟酸对6-羟基烟酸在发酵液中积累的影响第46-47页
   ·回补烟酸对烟酸、3-氰基吡啶羟基化的影响第47-48页
   ·双催化工艺偶联生产6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶第48-49页
  3.讨论第49-51页
第三章 吡啶衍生物羟基化酶基因的高通量筛选第51-72页
 第一节 C.testosteroni JA1抗性质粒消除的研究第51-55页
  1.材料与方法第51-52页
   ·菌株来源第51页
   ·菌株的纯化与活化第51页
   ·抗生素抗性检测第51页
   ·质粒抽提及检测第51-52页
   ·质粒的消除第52页
   ·质粒消除后菌株生长特性的检测第52页
  2.结果第52-54页
   ·JA1菌株对抗生素的抗性第52页
   ·质粒消除剂浓度的确定第52-53页
   ·质粒消除率第53页
   ·质粒消除后菌株特性的变化第53-54页
  3.讨论第54-55页
 第二节 基于微孔板的高通量测定烟酸脱氢酶活性方法的建立第55-60页
  1.材料和方法第55页
   ·主要试剂与仪器第55页
   ·实验方法第55页
  2.结果第55-58页
   ·吸收光谱和A的选择第55-56页
   ·工作曲线第56-57页
   ·稳定性试验第57页
   ·菌体代谢物干扰实验第57页
   ·样品的测定第57页
   ·回收率的测定第57-58页
   ·6-羟基烟酸转化菌的高通量筛选实例第58页
  3.讨论第58-60页
 第三节 鸟枪法克隆C.testosteroni JA1烟酸脱氢酶基因的尝试第60-72页
  1.材料与方法第60-66页
   ·菌株和质粒第60页
   ·主要仪器第60页
   ·培养基和试剂第60-61页
   ·菌体全基因组DNA的制备方法第61-62页
   ·DNA浓度及纯度测定方法第62页
   ·高拷贝质粒DNA的小量提取(碱变性法)第62-63页
   ·染色体DNA的部分酶切与酶切片段的回收第63页
   ·脱磷酸化载体pUC18的制备第63-64页
   ·电转化E.coli DH10B感受态细胞的制备方法第64页
   ·酶连及酶连产物的电击转化第64-65页
   ·本节技术路线第65-66页
  2.结果第66-71页
   ·C.testosteroni JA1全基因组DNA的获得第66页
   ·C.testosteroni JA1全基因组DNA浓度及纯度第66页
   ·总DNA的Sau3A Ⅰ不完全酶切第66-69页
   ·文库质量分析第69-70页
   ·阳性克隆的筛选第70-71页
  3.讨论第71-72页
第四章 吡啶衍生物羟基化酶的克隆与表达第72-116页
 第一节 KT2440 ndhSL基因簇的克隆与表达第72-96页
  1.材料和方法第72-84页
   ·材料第72-77页
   ·菌株培养与保藏第77页
   ·DNA操作第77-82页
   ·蛋白质分析及酶活测定第82-84页
  2.结果第84-94页
   ·KT2440烟酸脱氢酶活性第84页
   ·KT2440基因组上ndh基因克隆与分析第84-88页
   ·KT2440 ndhSL基因簇的表达与鉴定第88-92页
   ·KT2440 ndhSL基因簇的敲除第92-94页
  3.讨论第94-96页
 第二节 JA1 ndhSLM基因簇的克隆与表达第96-107页
  1.材料和方法第96-97页
   ·材料第96-97页
   ·菌株培养与保藏第97页
   ·DNA操作第97页
   ·蛋白质分析及酶活测定第97页
  2.结果第97-105页
   ·JA1 ndh基因克隆与分析第97-103页
   ·JA1 ndhSLM基因簇的表达与鉴定第103-105页
  3.讨论第105-107页
 第三节 NaDH功能域与底物特异性关系的探讨第107-116页
  1.材料和方法第107-108页
   ·材料第107-108页
   ·菌株培养与保藏第108页
   ·DNA操作第108页
   ·蛋白质分析及酶活测定第108页
  2.结果第108-112页
   ·NaDH_(KT2440)和NaDH_(JA1)功能域比对分析第108-109页
   ·NaDH_(KT2440)和NaDH_(JA1)蛋白亚基置换实验第109-112页
  3.讨论第112-116页
参考文献第116-128页
致谢第128-129页
附录第129-133页
 附录1 二十种常见氨基酸第129-130页
 附录2 质粒物理图谱第130-133页
 附录3 博士在读期间主要科研情况第133页

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