| 目录 | 第1-6页 |
| 缩写 | 第6-7页 |
| 中文摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-30页 |
| 一、烟碱类农药的发展 | 第14-16页 |
| 二、烟碱类农药合成中间体吡啶衍生物的研究 | 第16-17页 |
| 三、微生物转化烟酸合成吡啶衍生物的研究进展 | 第17-21页 |
| 四、微生物转化烟酸酶的研究进展 | 第21-25页 |
| 五.本课题的研究内容、思路及方法 | 第25-30页 |
| 1.研究内容 | 第25页 |
| 2.研究思路 | 第25页 |
| 3.研究中所涉及的主要研究方法概述 | 第25-30页 |
| 第二章 吡啶衍生物的微生物转化及偶联生产工艺的研究 | 第30-51页 |
| 第一节 C.testosteroni JA1菌株培养条件的优化研究 | 第30-37页 |
| 1.材料和方法 | 第30-31页 |
| ·材料 | 第30页 |
| ·菌体培养方法 | 第30页 |
| ·转化方法 | 第30-31页 |
| ·产物检测方法 | 第31页 |
| 2.结果 | 第31-36页 |
| ·JA1菌株的生长与产酶曲线 | 第31-32页 |
| ·碳源对菌体生长和产酶的影响 | 第32页 |
| ·氮源对菌体生长和产酶的影响 | 第32-33页 |
| ·诱导物对菌体生长和产酶的影响 | 第33页 |
| ·金属离子对菌体生长和产酶的影响 | 第33-35页 |
| ·温度对菌体生长和产酶的影响 | 第35页 |
| ·初始pH值对菌体生长和产酶的影响 | 第35页 |
| ·溶解氧量对菌体生长和产酶的影响 | 第35-36页 |
| 3.讨论 | 第36-37页 |
| 第二节 C.testosteroni JA1菌株静息细胞羟基化烟酸的条件优化研究 | 第37-43页 |
| 1.材料和方法 | 第37-38页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·菌体培养方法 | 第37页 |
| ·转化方法 | 第37页 |
| ·转化产物检测方法 | 第37-38页 |
| 2.结果 | 第38-41页 |
| ·pH值对转化效率的影响 | 第38页 |
| ·缓冲介质对转化效率的影响 | 第38-39页 |
| ·度对转化效率的影响 | 第39页 |
| ·底物浓度对转化效率的影响 | 第39-40页 |
| ·菌量对转化效率的影响 | 第40页 |
| ·转化底物特异性 | 第40-41页 |
| ·6-羟基烟酸的生产性能评价 | 第41页 |
| 3.讨论 | 第41-43页 |
| 第三节 烟酸和3-氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺的研究 | 第43-51页 |
| 1.材料和方法 | 第43-45页 |
| ·材料 | 第43页 |
| ·菌体发酵培养方法 | 第43页 |
| ·菌体生长细胞的转化方法 | 第43-44页 |
| ·菌体静息细胞转化方法 | 第44页 |
| ·转化产物的测定 | 第44页 |
| ·产物的分离与提纯 | 第44-45页 |
| 2.结果 | 第45-49页 |
| ·发酵液转化的时间进程 | 第45页 |
| ·起始烟酸浓度对发酵液中6-羟基烟酸积累的影响 | 第45-46页 |
| ·回补烟酸对6-羟基烟酸在发酵液中积累的影响 | 第46-47页 |
| ·回补烟酸对烟酸、3-氰基吡啶羟基化的影响 | 第47-48页 |
| ·双催化工艺偶联生产6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶 | 第48-49页 |
| 3.讨论 | 第49-51页 |
| 第三章 吡啶衍生物羟基化酶基因的高通量筛选 | 第51-72页 |
| 第一节 C.testosteroni JA1抗性质粒消除的研究 | 第51-55页 |
| 1.材料与方法 | 第51-52页 |
| ·菌株来源 | 第51页 |
| ·菌株的纯化与活化 | 第51页 |
| ·抗生素抗性检测 | 第51页 |
| ·质粒抽提及检测 | 第51-52页 |
| ·质粒的消除 | 第52页 |
| ·质粒消除后菌株生长特性的检测 | 第52页 |
| 2.结果 | 第52-54页 |
| ·JA1菌株对抗生素的抗性 | 第52页 |
| ·质粒消除剂浓度的确定 | 第52-53页 |
| ·质粒消除率 | 第53页 |
| ·质粒消除后菌株特性的变化 | 第53-54页 |
| 3.讨论 | 第54-55页 |
| 第二节 基于微孔板的高通量测定烟酸脱氢酶活性方法的建立 | 第55-60页 |
| 1.材料和方法 | 第55页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55页 |
| 2.结果 | 第55-58页 |
| ·吸收光谱和A的选择 | 第55-56页 |
| ·工作曲线 | 第56-57页 |
| ·稳定性试验 | 第57页 |
| ·菌体代谢物干扰实验 | 第57页 |
| ·样品的测定 | 第57页 |
| ·回收率的测定 | 第57-58页 |
| ·6-羟基烟酸转化菌的高通量筛选实例 | 第58页 |
| 3.讨论 | 第58-60页 |
| 第三节 鸟枪法克隆C.testosteroni JA1烟酸脱氢酶基因的尝试 | 第60-72页 |
| 1.材料与方法 | 第60-66页 |
| ·菌株和质粒 | 第60页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| ·培养基和试剂 | 第60-61页 |
| ·菌体全基因组DNA的制备方法 | 第61-62页 |
| ·DNA浓度及纯度测定方法 | 第62页 |
| ·高拷贝质粒DNA的小量提取(碱变性法) | 第62-63页 |
| ·染色体DNA的部分酶切与酶切片段的回收 | 第63页 |
| ·脱磷酸化载体pUC18的制备 | 第63-64页 |
| ·电转化E.coli DH10B感受态细胞的制备方法 | 第64页 |
| ·酶连及酶连产物的电击转化 | 第64-65页 |
| ·本节技术路线 | 第65-66页 |
| 2.结果 | 第66-71页 |
| ·C.testosteroni JA1全基因组DNA的获得 | 第66页 |
| ·C.testosteroni JA1全基因组DNA浓度及纯度 | 第66页 |
| ·总DNA的Sau3A Ⅰ不完全酶切 | 第66-69页 |
| ·文库质量分析 | 第69-70页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第70-71页 |
| 3.讨论 | 第71-72页 |
| 第四章 吡啶衍生物羟基化酶的克隆与表达 | 第72-116页 |
| 第一节 KT2440 ndhSL基因簇的克隆与表达 | 第72-96页 |
| 1.材料和方法 | 第72-84页 |
| ·材料 | 第72-77页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第77页 |
| ·DNA操作 | 第77-82页 |
| ·蛋白质分析及酶活测定 | 第82-84页 |
| 2.结果 | 第84-94页 |
| ·KT2440烟酸脱氢酶活性 | 第84页 |
| ·KT2440基因组上ndh基因克隆与分析 | 第84-88页 |
| ·KT2440 ndhSL基因簇的表达与鉴定 | 第88-92页 |
| ·KT2440 ndhSL基因簇的敲除 | 第92-94页 |
| 3.讨论 | 第94-96页 |
| 第二节 JA1 ndhSLM基因簇的克隆与表达 | 第96-107页 |
| 1.材料和方法 | 第96-97页 |
| ·材料 | 第96-97页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第97页 |
| ·DNA操作 | 第97页 |
| ·蛋白质分析及酶活测定 | 第97页 |
| 2.结果 | 第97-105页 |
| ·JA1 ndh基因克隆与分析 | 第97-103页 |
| ·JA1 ndhSLM基因簇的表达与鉴定 | 第103-105页 |
| 3.讨论 | 第105-107页 |
| 第三节 NaDH功能域与底物特异性关系的探讨 | 第107-116页 |
| 1.材料和方法 | 第107-108页 |
| ·材料 | 第107-108页 |
| ·菌株培养与保藏 | 第108页 |
| ·DNA操作 | 第108页 |
| ·蛋白质分析及酶活测定 | 第108页 |
| 2.结果 | 第108-112页 |
| ·NaDH_(KT2440)和NaDH_(JA1)功能域比对分析 | 第108-109页 |
| ·NaDH_(KT2440)和NaDH_(JA1)蛋白亚基置换实验 | 第109-112页 |
| 3.讨论 | 第112-116页 |
| 参考文献 | 第116-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 附录 | 第129-133页 |
| 附录1 二十种常见氨基酸 | 第129-130页 |
| 附录2 质粒物理图谱 | 第130-133页 |
| 附录3 博士在读期间主要科研情况 | 第133页 |
