| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-18页 |
| 1 柿果贮藏保鲜技术的研究现状 | 第12-13页 |
| 2 乙烯与果实成熟 | 第13页 |
| 3 乙烯生物合成的研究进展 | 第13-15页 |
| ·乙烯生物合成与调控过程 | 第13-14页 |
| ·乙烯的生物合成基因工程与果实成熟 | 第14-15页 |
| ·ACC合成酶基因(ACS)与果实成熟 | 第14页 |
| ·ACC氧化酶基因(ACO)与果实成熟 | 第14-15页 |
| ·SAM水解酶基因、ACC脱氨酶基因与果实成熟 | 第15页 |
| 4 反义RNA技术 | 第15-16页 |
| 5 RNA干扰技术 | 第16-17页 |
| 6 本研究的目的、意义 | 第17-18页 |
| 第二章 柿果ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆 | 第18-28页 |
| 1 材料与试剂 | 第18-19页 |
| ·植物材料 | 第18页 |
| ·菌株和载体 | 第18页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第18页 |
| ·主要仪器 | 第18-19页 |
| ·主要试剂溶液的配制 | 第19页 |
| 2 试验方法 | 第19-24页 |
| ·柿果中总RNA的提取及其浓度的检测 | 第19-20页 |
| ·柿果中总RNA的提取 | 第19-20页 |
| ·检测RNA的质量与纯度 | 第20页 |
| ·mRNA的反转录 | 第20页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第20-21页 |
| ·引物设计与合成 | 第20-21页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第21页 |
| ·目的扩增片段的回收 | 第21-22页 |
| ·目的片段与T载体连接 | 第22页 |
| ·连接产物的转化 | 第22页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第22页 |
| ·连接产物的转化 | 第22页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第22-23页 |
| ·蓝白斑(a-互补)筛选和菌液PCR鉴定 | 第23页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒DNA | 第23页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第23页 |
| ·阳性克隆的序列测定及其同源性分析 | 第23-24页 |
| 3 结果与分析 | 第24-28页 |
| ·柿果中RNA的提取质量 | 第24页 |
| ·电泳检测RT-PCR产物 | 第24-25页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第25页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第25-26页 |
| ·阳性克隆的序列测定及同源性分析 | 第26-28页 |
| 第三章 柿果ACC氧化酶基因片段内含子的去除 | 第28-35页 |
| 1 材料与试剂 | 第28页 |
| 2 试验方法 | 第28-31页 |
| ·两个目的片段的PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·引物设计与合成 | 第28页 |
| ·PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·两个目的片段的酶切、纯化和连接 | 第29-30页 |
| ·EcoR Ⅴ酶切两个PCR片段 | 第29页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第29页 |
| ·酶切产物的连接 | 第29-30页 |
| ·连接产物(ACOL)的初步鉴定 | 第30页 |
| ·PCR鉴定 | 第30页 |
| ·酶切鉴定 | 第30页 |
| ·连接产物(ACOL)的进一步鉴定 | 第30-31页 |
| ·ACOL与T载体连接 | 第30-31页 |
| ·连接产物的转化 | 第31页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第31页 |
| ·阳性克隆的序列测定及比较分析 | 第31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-35页 |
| ·电泳检测两个目的片段的PCR扩增产物 | 第31-32页 |
| ·连接产物(ACOL)的PCR鉴定及Sac Ⅰ酶切鉴定的电泳检测 | 第32-33页 |
| ·电泳检测ACOL的菌液PCR产物 | 第33页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆的序列测定及比较分析 | 第34-35页 |
| 第四章 柿果ACC氧化酶基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化 | 第35-56页 |
| 1 材料与试剂 | 第35页 |
| ·菌株和表达载体 | 第35页 |
| ·试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器与设备 | 第35页 |
| ·主要试剂及培养基的配制 | 第35页 |
| 2 方法 | 第35-44页 |
| ·ACC氧化酶基因反义植物表达载体的构建 | 第35-39页 |
| ·pBI-anti-ACO中间载体的构建 | 第37-38页 |
| ·pSMAK-anti-ACO表达载体的构建 | 第38-39页 |
| ·ACC氧化酶基因RNAi植物表达载体的构建 | 第39-43页 |
| ·pBI-ACO-RNAi中间载体的构建 | 第41-42页 |
| ·pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建 | 第42-43页 |
| ·构建好的植物表达载体向农杆菌中转化 | 第43-44页 |
| ·表达载体质粒的大量提取 | 第43页 |
| ·农杆菌(EHA101)感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·表达载体向农杆菌的转化 | 第44页 |
| ·阳性菌落的鉴定 | 第44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-56页 |
| ·正义片段与反义片段的PCR扩增 | 第44-45页 |
| ·反义植物表达载体的构建及检测 | 第45-49页 |
| ·pBI-anti-ACO中间载体的构建 | 第45-46页 |
| ·pBI-anti-ACO中间载体的鉴定 | 第46-47页 |
| ·pSMAK-anti-ACO表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·pSMAK-anti-ACO表达载体的鉴定 | 第48-49页 |
| ·RNAi植物表达载体的构建及检测 | 第49-54页 |
| ·pBI-ACO-RNAi中间载体的构建 | 第49-50页 |
| ·pBI-ACO-RNAi中间载体的鉴定 | 第50-52页 |
| ·pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建 | 第52页 |
| ·pSMAK-ACO-RNAi表达载体的鉴定 | 第52-54页 |
| ·农杆菌中表达载体的菌液PCR鉴定 | 第54-56页 |
| 第五章 讨论 | 第56-59页 |
| 1 关于柿果ACC氧化酶的研究 | 第56页 |
| 2 关于ACC氧化酶的基因克隆 | 第56-57页 |
| ·柿果组织中总RNA的提取 | 第56页 |
| ·含有酶切位点的引物设计 | 第56-57页 |
| ·温度设置 | 第57页 |
| 3 关于ACO基因片段内含子的去除 | 第57页 |
| 4 关于表达载体的构建 | 第57-59页 |
| ·表达载体的选择 | 第57页 |
| ·限制性内切酶的使用 | 第57-58页 |
| ·连接片段的浓度比 | 第58-59页 |
| 第六章 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 作者简介 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 附录 | 第67-73页 |