| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-7页 |
| 引言 | 第7-9页 |
| 第一部分 pSNAV_2-CTGF-IRES-TIMP1双表达质粒的活性检测及包装材料和方法 | 第9-30页 |
| 一、材料 | 第9-11页 |
| 1.质粒、细菌和细胞株 | 第9页 |
| 2.实验试剂和仪器 | 第9-11页 |
| 二、方法 | 第11-18页 |
| 1.重组质粒pSNAV_2-CTGF-IRES-TIMP1的PCR和酶切鉴定 | 第11-12页 |
| ·引物设计 | 第11页 |
| ·PCR鉴定 | 第11-12页 |
| ·酶切鉴定 | 第12页 |
| 2.超纯pSNAV_2-CTGF-IRES-TIMP1双表达质粒的制备 | 第12-13页 |
| ·感受态埃希大肠杆菌的制备和转化 | 第12-13页 |
| ·超纯质粒的提取 | 第13页 |
| 3.pSNAV_2-CTGF-IRES-TIMP1的活性检测 | 第13-17页 |
| ·HEK293细胞的培养 | 第13页 |
| ·NIH/3T_3细胞的培养 | 第13-14页 |
| ·脂质体介导的HEK293细胞的转染 | 第14页 |
| ·双重免疫荧光检测CTGF和TIMP1在细胞内的定位及表达 | 第14页 |
| ·Western blot检测CTGF和TIMP1目的蛋白的表达 | 第14-16页 |
| ·MTT法检测CTGF蛋白的活性 | 第16页 |
| ·ELISA检测TIMP1蛋白的活性 | 第16-17页 |
| 4.pSNAV_2-CTGF-IRES-TIMP1双表达质粒的包装 | 第17页 |
| 5.统计学处理 | 第17-18页 |
| 三、结果 | 第18-30页 |
| 1.PCR和酶切鉴定结果 | 第18-19页 |
| 2.双表达质粒的测序结果及浓度 | 第19-24页 |
| 3.HEK293细胞 | 第24页 |
| 4.NIH/3T_3细胞 | 第24-25页 |
| 5.HEK293细胞的转染后的形态学改变 | 第25页 |
| 6.双重免疫荧光结果 | 第25-26页 |
| 7.Western blot结果 | 第26页 |
| 8.MTT结果 | 第26-27页 |
| 9.ELISA检测结果 | 第27-29页 |
| 10.双表达质粒包装结果 | 第29-30页 |
| 第二部分 CTGF和TIMP1双基因联合体外转染人退变髓核细胞的生物学效应材料和方法 | 第30-41页 |
| 一、材料 | 第30-31页 |
| 1.细胞和病毒载体 | 第30页 |
| 2.实验试剂和仪器 | 第30-31页 |
| 二、方法 | 第31-35页 |
| 1.人退变椎间盘髓核细胞的培养 | 第31页 |
| 2.人退变髓核细胞的免疫组化鉴定和Safranine O染色 | 第31-32页 |
| ·细胞爬片的制备 | 第31页 |
| ·PV-6000二步法免疫组化操作步骤 | 第31页 |
| ·Safranine O染色 | 第31-32页 |
| 3.CTGF和TIMP1双基因联合体外转染人退变髓核细胞 | 第32页 |
| ·转染步骤 | 第32页 |
| ·形态学观察 | 第32页 |
| 4.氯胺T法细胞基质胶原含量的测定 | 第32页 |
| 5.免疫组织化学法检测髓核细胞Ⅱ型胶原的合成 | 第32页 |
| 6.~(35)S整合法测定退变髓核细胞蛋白多糖合成率 | 第32-34页 |
| ·原理 | 第32-33页 |
| ·试剂的配制 | 第33页 |
| ·髓核细胞的培养及处理 | 第33-34页 |
| ·~(35)S放射率的测定 | 第34页 |
| 7.Antonopoulos法细胞基质蛋白多糖含量的测定 | 第34-35页 |
| 三、结果 | 第35-41页 |
| 1.人退变髓核细胞的培养结果 | 第35页 |
| 2.人退变髓核细胞的免疫组化鉴定结果和Safranine O染色 | 第35-36页 |
| 3.双基因联合体外转染人退变髓核细胞形态学观察 | 第36-37页 |
| 4.氯胺T法细胞基质胶原含量的测定结果 | 第37页 |
| 5.免疫组化法检测髓核细胞Ⅱ型胶原合成的结果 | 第37-38页 |
| 6.~(35)S整合法测定人退变髓核细胞蛋白多糖合成的结果 | 第38-39页 |
| 7.Antonopoulos法细胞基质蛋白多糖含量的测定结果 | 第39-41页 |
| 讨论 | 第41-46页 |
| 结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 文献综述:基质金属蛋白酶及其抑制因子与腰椎间盘退变 | 第50-62页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第62-63页 |
| 附录 | 第63-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
