| 中文摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-7页 |
| 1 前言 | 第7-22页 |
| ·背景资料 | 第7-9页 |
| ·本实验采用的pSUPER载体的具体原理如下 | 第8页 |
| ·外源插入片断 | 第8-9页 |
| ·siRNA靶位点—19nt的选择原则 | 第9页 |
| ·文献综述 | 第9-22页 |
| ·HIV | 第9-14页 |
| ·HIV感染的流行现状 | 第9-10页 |
| ·艾滋病的发病机理 | 第10页 |
| ·HIV的基因结构 | 第10-12页 |
| ·Nef的功能 | 第12-14页 |
| ·SIVNef的致病作用 | 第14页 |
| ·RNA干扰(RNAinterference,RNAi) | 第14-22页 |
| ·RNAi的发展简史 | 第14-15页 |
| ·RNAi的基本原理 | 第15-18页 |
| ·RNAi技术的主要途径 | 第18页 |
| ·针对目的基因的特异序列的选择 | 第18-19页 |
| ·RNAi技术的主要应用 | 第19-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-35页 |
| ·材料 | 第22-24页 |
| ·实验方法 | 第24-35页 |
| ·细胞培养 | 第24-25页 |
| ·冻存细胞的复苏 | 第24页 |
| ·细胞培养 | 第24-25页 |
| ·细胞冻存 | 第25页 |
| ·pSUPER—RNAi质粒的构建 | 第25-27页 |
| ·制备长度为64bp的双链核苷酸插入片断 | 第25页 |
| ·线性载体的制备 | 第25-26页 |
| ·连接反应 | 第26页 |
| ·转化大肠杆菌(热休克法) | 第26页 |
| ·小提质粒酶切鉴定 | 第26-27页 |
| ·质粒大量制备 | 第27页 |
| ·pEGFP-Nef融合蛋白的构建 | 第27-29页 |
| ·提取病毒感染后的CEM细胞基因组DNA: | 第27-28页 |
| ·PCR反应体系按Promega公司Taq酶说明书设计(50μl) | 第28页 |
| ·PCR产物的回收 | 第28页 |
| ·质粒pEGFP-N1的酶切和回收 | 第28页 |
| ·连接反应 | 第28-29页 |
| ·感受态E.coli DH5α的制备和转化 | 第29页 |
| ·重组体的鉴定 | 第29页 |
| ·DNA序列分析 | 第29页 |
| ·质粒大量制备 | 第29页 |
| ·转染 | 第29-30页 |
| ·RT-PCR检测 | 第30-31页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第30页 |
| ·RNA电泳 | 第30页 |
| ·RT-PCR反应 | 第30-31页 |
| ·Western分析蛋白表达 | 第31-35页 |
| ·蛋白提取: | 第31-32页 |
| ·考马斯亮蓝法测蛋白浓度 | 第32页 |
| ·样品蛋白的浓度测定 | 第32页 |
| ·不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第32-35页 |
| 3 实验结果 | 第35-39页 |
| ·重组质粒pEGFP-NEF的构建 | 第35页 |
| ·pSUPER-RNAI质粒的构建 | 第35-36页 |
| ·SHRNA对NEF基因表达的抑制效果 | 第36-39页 |
| ·荧光显微镜观察转染Hela细胞中shRNA对nef基因表达的抑制效果 | 第36-37页 |
| ·RT-PCR检测shRNA对nef基因表达的抑制效果 | 第37-38页 |
| ·Western Blot检测检测shRNA对nef基因表达的抑制效果 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39-41页 |
| 5 结论 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-46页 |
| 英文缩略词表 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47页 |
