含硒谷胱甘肽硫转移酶在大肠杆菌中的表达
| 第一章 文献综述 | 第1-25页 |
| 1 谷胱甘肽过氧化物酶 | 第9-13页 |
| ·GPX的结构 | 第9-11页 |
| ·GPX的催化机制 | 第11-13页 |
| ·GPX的生物学作用 | 第13页 |
| 2 GPX的人工模拟 | 第13-16页 |
| ·Ebselen及其衍生物 | 第13-14页 |
| ·硒代谷胱甘肽(GSeH) | 第14页 |
| ·硒化及碲化环糊精 | 第14-15页 |
| ·硒化枯草杆菌蛋白酶 | 第15页 |
| ·含硒抗体酶 | 第15-16页 |
| 3 谷胱甘肽硫转移酶 | 第16-18页 |
| ·GST的分类 | 第16页 |
| ·GST的三维结构 | 第16-18页 |
| ·GST的生物学作用 | 第18页 |
| 4 硒代半胱氨酸 | 第18-25页 |
| ·硒代半胱氨酸表达机制 | 第19-20页 |
| ·原核生物的硒代半胱氨酸插入元件 | 第20-22页 |
| ·真核生物的SECIS | 第22-23页 |
| ·硒蛋白的原核表达 | 第23-25页 |
| 第二章 本论文的立论依据及目的 | 第25-27页 |
| 第三章 含硒GST表达系统的构建 | 第27-40页 |
| 第一节 含硒GST突变体的构建 | 第27-37页 |
| 1 实验材料 | 第28-29页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·质粒和菌株 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第28-29页 |
| 2 实验方法 | 第29-33页 |
| ·质粒的提取 | 第29页 |
| ·重叠PCR引入定点突变 | 第29-31页 |
| ·突变密码子UGA的引入 | 第29-30页 |
| ·最小SECIS突变的引入 | 第30-31页 |
| ·突变体seleno-GTS的构建 | 第31页 |
| ·目的基因与表达载体的限制性内切酶消化 | 第31页 |
| ·酶切产物的连接 | 第31-32页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32-33页 |
| ·阳性克隆的筛选及其鉴定 | 第33页 |
| ·重组质粒及其菌种的保存 | 第33页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第33页 |
| 3 结果与讨论 | 第33-37页 |
| ·突变密码子UGA的引入 | 第33-34页 |
| ·最小SECIS的引入 | 第34页 |
| ·突变体seleno-GTS的构建 | 第34-35页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·含硒GST突变体基因的鉴定 | 第36页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第36-37页 |
| 第二节 含硒GST的融合表达系统的构建 | 第37-40页 |
| 1 实验材料 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-38页 |
| ·目的基因的扩增 | 第37页 |
| ·目的基因与表达载体的限制性内切酶消化 | 第37-38页 |
| ·酶切产物的连接 | 第38页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38页 |
| ·连接产物的转化 | 第38页 |
| ·阳性克隆的筛选及其鉴定 | 第38页 |
| 3 结果与讨论 | 第38-40页 |
| ·目的基因P34的扩增 | 第38-39页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定结果 | 第39-40页 |
| 第四章 含硒GST融合蛋白的表达及分离纯化 | 第40-52页 |
| 1 实验材料 | 第40-41页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·主要仪器 | 第40-41页 |
| ·主要溶液的配制 | 第41页 |
| 2 实验方法 | 第41-44页 |
| ·转化 | 第41页 |
| ·诱导表达 | 第41-42页 |
| ·含硒GST的鉴定 | 第42-43页 |
| ·蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第42页 |
| ·硒元素放射性标记 | 第42页 |
| ·Western Blotting | 第42-43页 |
| ·含硒GST分离纯化 | 第43-44页 |
| ·亲和层析 | 第43-44页 |
| ·高压液相分离GSH亲和洗脱组分 | 第44页 |
| ·含硒GST的GPX活力测定 | 第44页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第44页 |
| 3 结果与讨论 | 第44-52页 |
| ·含硒GST融合蛋白的表达 | 第44-45页 |
| ·75Se放射性自显影鉴定表达产物 | 第45-47页 |
| ·Western Blotting | 第47-48页 |
| ·含硒GST融合蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| ·谷胱甘肽琼脂糖亲和层析 | 第48页 |
| ·高效液相分离纯化 | 第48-49页 |
| ·含硒GST融合蛋白表达量测定 | 第49-52页 |
| ·含硒GST融合蛋白表达量的估算 | 第50页 |
| ·突变密码子UGA通读效率的估测 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 中文摘要 | 第59-62页 |
| ABSTRACT | 第62-65页 |
| 附录一 PCR引物序列 A | 第65-66页 |
| 附录二 测序结果 B | 第66页 |
